关键词:proimmune公司免疫重组细胞
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产品简介：
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英国ProImmune 公司是免疫学功能检测多聚体产品和服务*的*。产品包括重组的MHC Class I 五聚体和MHCClass II 六聚体，用于特异性的T 细胞免疫功能检测。广泛用于肿瘤，传染性疾病，自身免疫学疾病和移植等热门领域的基础，新药和临床研究。
五聚体(ProImmune)结合胞内细胞因子染色在国外正在成为很多实验室的常规实验。五聚体可用于检测和分离少至淋巴细胞0.02%的抗原特异性CD8+T细胞群。然而，并不是所有的抗原特异性T细胞都具有功能，功能性细胞的比例因个体和疾病不同而异。可以通过对另外的胞内细胞因子联合染色来研究抗原特异性T细胞的免疫效应功能。
细胞因子的产生对免疫反应起着重要的作用。细胞因子作用的范例包括干扰素-γ（IFNγ）诱导产生的许多抗病毒蛋白、IL-2诱导产生的T细胞增殖、以及肿瘤坏死因子α（TNFα）对病毒基因表达和复制的抑制。细胞因子不是预先形成的，而是在受到相关刺激时才迅速产生和分泌的。因此，胞内细胞因子的染色依赖于在蛋白转运抑制剂存在的情况下（以将细胞因子截留在细胞内）对细胞的刺激。
激起细胞因子产生的细胞活化一般会导致T细胞受体的下调。因此，如果需要同时检测T细胞特异性，则应在细胞活化前进行Pro5R五聚体染色以确保染色水平。在此期间五聚体可能会与T细胞受体一同被内化，但仍可以在透化细胞内检测到。研究抗原特异性T细胞的效应功能时，先将细胞以五聚体染色，然后再用抗原刺激，随后用针对细胞外表位（如CD8）的特异性抗体进行染色，zui后再进行膜透化和胞内细胞因子染色。
材料和仪器：
1）细胞样本（如PBMCs）
2）Pro5RMHC Class Ⅰ五聚体连接荧光标记（如R-PE）
3）荧光标记的细胞因子抗体，如anti-human IFNγFITC; ProImmune(不同荧光标记的五聚体)
4）荧光标记的CD8抗体
5）肽（储存在50mg/mL的DMSO中—可分装保存于-20℃）
6）Leukocyte activation cocktail (LAC; 可选) 作为细胞因子产物对照（BD Biosciences#55083—可分装保存在-80℃）
7）细胞因子IC对照细胞（可选）用于在胞内细胞因子染色时的阳性对照（eBioscience#00-4509）
8）PBS缓存液（含2%FCS，0.1%叠氮钠）
9）Permeabilization缓存液（含0.1%saponin，1%FCS，0.1%叠氮钠的PBS）
10）4% Paraformaldehyde多聚甲醛
11）Fix buffer（含1%热灭活小牛血清HI-FCS，2.5%甲醛的PBS）
12）R10培养液（RPMI1640，含10%HI-FCS，10mMHEPES，50mM 2-ME，）
13）Brefeldin A（Sigma #15870）
14）12×75mm 圆底管
15）台式冷冻离心机，水平转子和配套管架
16）冷冻微型离心机
17）CO2，37℃培养箱
18）涡旋混合器
Pro5R五聚体结合胞内细胞因子染色检测IFNγ、TNFα、MIP-1β或IL-2
操作步骤：步骤10前的所有操作在无菌环境下进行，使用无菌缓存液和无菌条件。
1.离心Pro5R五聚体，冷冻微型离心机（14000×g，5min）。
2.制备外周血细胞，PBS中细胞浓度2×107cells/ml。
3.分别将细胞悬液50μl加入到多个试管中。
4.添加荧光标记的五聚体到需要的试管中，22℃孵育10min（无刺激的信号对照在该步骤时不要染色）。在剩下的试管中加入10μl的PBS。
5.在每个管中加入500μlPBS，离心450×g，5min，10℃。
6.去掉上清液，震动分散细胞，用200μl的R10培养液重悬。
7.用R10培养液1:50稀释肽蛋白原液。取2μl（终浓度10μg/ml）加入到需要的管中。
如果使用LAC作为对照，在37℃水浴中快速复溶，取0.33μl至每个需要的管。使用后，丢弃剩下的LAC。
8.将试管置于37℃，加湿CO2培养箱中孵育15min-1h。
9.加入Brefeldin A（终浓度10μg/ml）到需要的管中（注意：LAC中含有Brefeldin A），重新放回培养箱中孵育15h。孵育中产生特定细胞因子的*刺激阶段是不同的，是需要确定的。上述实验中16h的孵育时间是对人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激诱导产生IFNγ的*孵育时间。根据刺激方法和选择的细胞因子效应，孵育时间各不相同。
10.从培养箱中取出试管，离心450×g，5min，10℃。
11.去除上清，在需要的管中用50μl含*浓度的anti-CD8抗体的PBS重悬细胞，其它管中加50μlPBS。
信号-颜色对照在此步骤时染色。另外，如果需要样本额外的亚型，针对其它细胞表面标志或受体的抗体也在这时加入。
12.冰上孵育20min。
13.每管加入500μlPBS洗涤，离心450×g，5min，10℃。
14.去除上清，震动分散细胞。
15.每个样本管加入200μl 4% Paraformaldehyde，涡旋混匀。冰上孵育20min。
此步中要固定活细胞形态。
此步时操作可以暂停，重复进行13和14步，重悬细胞，100μlPBS/管，遮盖管口，细胞放4℃可储存3天。再次进行操作时，重复步骤13和14，重悬细胞每管200μl Permeabilization，然后进行步骤17。
16.每管加入200μl Permeabilization。
17.离心450×g，5min，10℃，弃上清。
18.样品管加入100μl Permeabilization，用抗细胞因子抗体染色。在剩余管（如信号-颜色对照）中加入100μl的PBS。
19.室温孵育5min。
20.加入*浓度的FITC-抗细胞因子抗体到需要的样品管中，混匀。
21.室温孵育20min。
22.每管加入200μl Permeabilization，离心450×g，5min，10℃，弃上清，震动分散细胞。
23.200μl Fix buffer重悬细胞，涡旋混匀。
加入固定液时涡旋是很重要的，以使细胞不会成团。
注意：
1.孵育阶段：特定的细胞因子诱导刺激的*时间是不同的需要确定的。上述实验中16h的孵育时间是对人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激诱导产生IFNγ的*孵育时间。根据刺激方法和选择的细胞因子效应，孵育时间各不相同。
2.肽蛋白浓度：调查细胞因子反应效应的滴度。
3.五聚体染色：细胞活化产生细胞因子可能会使T细胞受体下调，这会影响随后的五聚体染色，所以，推荐五聚体在细胞活化之前染色。
4.抗体浓度：调查anti-CD8和anti-cytokine抗体的有效滴度。anti-CD8抗体滴度会阻止其它抗体介导的封闭或与五聚体竞争结合的位点。
5.蛋白质转运抑制：Brefeldin A抑制细胞内蛋白的转运。细胞培养环境中BrefeldinA菌的存在会阻止蛋白质在高尔基复合体的转运，使蛋白质积聚在内质网内。Brefeldin A菌会增强大多数胞内细胞因子的检测，所以，建议在特定的实验中需要检查实验试剂的有效性，是否含有蛋白质转运制抑制剂（如Monensin）。
6.背景染色：当进行五聚体染色时，如果背景染色过高，需先用Fc封闭或10%小鼠血清来封闭细胞。其它减少非特异染色的方法可参见ProImmune相关技术文献。
7.如果需要没有五聚体结合的胞内细胞因子染色则去掉实验步骤1-4
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