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柱色谱有分配色谱和吸附色谱两种。分配色谱原理是溶质分子在两种不同混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。吸附色谱其原理是利用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解吸能力不同，让混合物随流动相流过固定相，发生了反复多次的吸附和解吸过程，从而使混合物分离成两种或多种单一的纯组分。柱层析中通常是吸附色谱。
在用柱色谱分离混合物时，将已溶解的样品加入到已装好的色谱柱顶端，吸附在固定相（吸附剂）上，然后用洗脱剂（流动相）进行淋洗，流动相带着混合物的组分下移。样品中各组分在吸附剂上的吸附能力不同，通常来说，极性大的吸附能力强，极性小的吸附能力相对弱一些。且各组分在洗脱剂中的溶解度也不一样，而被解吸的能力也就不同。非极性组分由于在固定相中吸附能力弱，首先被解吸出来，被解吸出来的非极性组分随着流动相向下移动与新的吸附剂接触再次被固定相吸附。随着洗脱剂向下流动，被吸附的非极性组分再次与新的洗脱剂接触，并再次被解吸出来随着流动相向下流动。而极性组分由于吸附能力强，因此不易被子解吸出来，随着流动相移动的速度比非极性组分要慢得多（或根本不移动）。这样经过反复的吸附和解吸后，各组分在色谱柱上形成了一段一段的层带，若是有色物质，可以看到不同的色带。随着洗脱过程的进行从柱底端流出。每一色带代表一个组分，分别收集不同的色带，再将脱洗剂蒸发，就可以得到单一的纯物质。
柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。通常情况下收集的情况如下：10mg上样量，1g硅胶，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶，20～50ml收一馏分。具体情况要看待分离的物质决定，附2文有一定参考价值。
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