斑点杂交实验服务实验注意事项

实验技术简介:斑点杂交(Dotblot) 是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。- 张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪(Manifold) , 如MinifoldI和II. Smart Botter(Wealtec).Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。

实验技术原理:

斑点杂交是指将待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜(或尼龙膜、NC膜)上, 用已标记的探针进行杂交，洗膜(除去未接合的探针)， 放射自显影，判断是否有杂交及其杂交强度，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。

实验操作流程:

1. DNA斑点杂交

①先将膜在水中浸湿，再放到15*SSC中。

②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min,冰中速冷。

③用铅笔在滤膜上标好位置将DNA点样于膜上，每个样品-般点5ul(2~10μg DNA)。

④将膜烘干，密封保存备用。

2、RNA斑点杂交

与上法类似、，每个样品至多加10μg总RNA (经酚/氨0仿或异硫青酸胍提取纯化)。 方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μI甲醛/SSC缓冲液(10*SSC中含6.15moI/L甲醛) ，使RNA变性，然后取5-8μI点样于处理好的滤膜上，烘干。

3、完整细胞斑点杂交

应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。

实验注意事项:

客户提供:

TotalRNA (DNA) ≥20ug,浓度> 1ug/ul, A260/A280>1.8;提供标记后的探针，需同时告知标记后探针的浓度及活性，待检测目的基因的Genbank序列号。

交付标准:

1、图片

2.完整项目报告(材料、试剂、仪器、方法、数据分析、实验结果)

其他:

1.点样量不要太大，否则杂交后，X光片上点太大，互相影响。

点样前尼龙膜无需预处理，点样后自然晾干后， 分别在变性液和中和液中进行变性和中和。

收费标准/服务周期/提供结果:

欢迎咨询详谈，我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。

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