Beutler改良法测定组织GSH操作规程

• 原理及意义

原理：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸，而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色，在412 nm波长下有吸收峰。

意义：还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）是一种低分子自由基清除剂，它可清除O₂˙ 、H₂O₂、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤，zui近还证明GSH也参与使Vit E恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。

• 器材

可见光分光计、7 ml离心管和管架、加样器和枪头

• 试剂

① 1 mmol/L的GSH（标准品）；

② 1％柠檬酸钠；

③ 二硫双基苯甲酸（dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB）试剂：用1％柠檬酸钠配成终浓度0.04％（w/v）；

④ 20％三氯醋酸；

⑤ 0.3 mol/L磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）缓冲液。

• 步骤

1、样品处理及试验步骤（下面以肝脏组织为例）

称取一定量的肝脏组织于冰冷0.85％生理盐水中漂洗，滤纸吸干表面水分，烧杯内剪碎     制备20%组织匀浆液（须用0.85％生理盐水或三蒸水）    4000 g离心10 min后取上清液      按上清液:20％三氯醋酸（体积比）为2:1混合（加TCA前留取20 μl上清液用于Lowry法测蛋白）     混匀，4000 g离心10 min（此步离心要充分，可适当提高离心力）     收集上清液按表2测定。

2、按下表1绘制标准曲线（单位：ml）

表1 GSH标准曲线的测定

混匀，5 min内于412nm比色，以三蒸水调零，以标准GSH浓度为X轴，相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线，并求回归方程。

3、按下表2操作测定样品GSH（单位：ml）

表2  Beutler改良法样品测定操作

测得的吸光值代入回归方程，可计算出样品液的GSH浓度。

• 实验结果

1、标准曲线结果

根据上数据测得标准曲线方程为：

X(μmol)=0.3744898 Y+0.0017227（其中Y为吸光值，标准曲线看Figure 1）

Figure 1  GSH标准曲线图

• 注意事项

• 样品应冰上匀浆，所有步骤尽量保证低温下操作，否则结果偏低；
• 所有用水均需三蒸水，否则结果偏低；
• 未经蛋白变性处理的样品在－20℃不宜存放；
• 反应管内zui终PH值必须保证在8.0～9.0间，否则结果不稳定；
• 配好的DTNB应在有限期内使用（4℃下可存1个月）；
• GSH浓度低时显色快，消退也快；浓度高时显色慢，消退也慢，一般反应1～5 min后测定（不要超过5 min）；
• 反应总体积可调为2.5 ml。