显微镜—标本制备和图像采集

显微镜—标本制备和图像采集

许多用于共聚焦显微镜的实验技术方法，多以普通光学显微镜为基础，必要时进f?改进以适合共日焦显微镜的需要。对于普通显微镜，主要方法是降低焦点以外的荧光干扰。与普通光学显微镜相比，事聚焦显微镜可进行厚标本深部的荧光观察，对标本的染色要求染色的时间较长或荧光探针的浓度较高这对于普通光学显微镜可能造成染色过度，而无法分辨其细节。

典型的LSCM系统，尽管每秒扫捞多点，但其扫描强度大、亮度高。通常每点扫描时间为1。6p5对于每点的平均照明强度相对处于中等水平，比普通荧光显微镜低，对组织损伤小：许多实验技术使只丁抗光源白刑，可防止激光光束对荧光团的光漂白作用。为防止激光对荧光探针的光漂白作用，尽可闭使用zui低强度的激光，现代的高水平LSCM，可以不使用抗光漂白剂。

显微镜—标本制备和图像采集

    LSCM的应用，使得较厚切片的图像质量得到较大的改善。标本必须*地适合显微镜的镜台，至观察的区域应当在显微镜镜头的工作距离之内。如高分辨串的60x，NA（数值孔径）1．4的物镜其工作距离为170μm；而凹x，NA o．75的物镜其工作距离可达660μm。为观察合适的区域，有时必须以损失分辨率为代价，否则，使用不适当的镜头，可能造成标本被压碎或损伤。

透光性和浑浊度可影响激光束的穿透深度，未固定和末染色的眼角膜上皮相当透明，激光束可穿适深达200μm左友而对于未固定的皮肤组织，其穿透深度仅约为10Pμm，因为它透明度很差．光散射多‘组织的作用就保中密度滤光片，可减弱激光束。在固定过程中加入某些透明刑可增加组织的透明度。

显微镜—标本制备和图像采集

激光能穿透较厚的标本这一问题解决后，可用普通切片机切出较厚的切片，也可用振动切片机制备恬体腑组织切片，在LSCM下，可获得良好的标记效果。为了观察标本深部也可将标本从切片取下．佼其颠倒后再贴到切片上进行观察，从两个方向观察标本。也可用长波长激发的荧光染料，如CY5来标汇标本较深部位的物质，而不用短波长激发的荧光染料标记。与短波长荧光染料标记的图像相比，其分辨率略有降低，但却获得了较强的穿透力。多光子LSCM，因为采用了红光作为激发光，则有利于从标本的深部采集图像。

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