组织磷酸二酯酶总活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书

YIJI 组织磷酸二酯酶总活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI组织磷酸二酯酶（PDE）总活性酶连续循环光度法定量检测试剂是一种旨在通过磷酸二酯酶、肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）环核苷酸依赖性（包括cAMP或cGMP）磷酸二酯酶的总活性，以及抑制剂和调节剂检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

磷酸二酯酶（phosphodiesterase；PDE；EC3.1.4.17 ），又称为环核苷酸磷酸二酯酶（cyclic nucleotide phosphodiesterase），包括腺苷-3',5'-环化一磷酸（cyclic adenine monophosphate；cAMP）或鸟苷-3',5'-环化一磷酸（cyclic guanine monophosphate；cGMP）。通过水解环核苷酸（cAMP或cGMP）的磷酸二酯键（phosphodiester?bond）产生5’-核苷（5’-nucleotides），使环核苷酸失活，达到调控第二信使分子环核苷酸的水平。其中环腺苷酸（cAMP）是存在于所有生命体细胞内重要的第二信使，以调节细胞形态、生长、分化、炎症、蛋白磷酸化、基因转录等各种功能。基于氨基酸序列、底物特异性、调节特征、组织分布和药理特性等，磷酸二酯酶家属分为11种亚酶，例如PDE4/7/8是cAMP为底物；PDE5/6/9是cGMP为底物；PDE1/2/3/10是cAMP/cGMP为底物等，具有不同的生化特性、组织表达特异性和通路特征。 磷酸二酯酶与勃起障碍（erectile dysfunction）、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease；COPD）、学习障碍、情绪抑郁和记忆功能、神经退行性病变、自动免疫性疾病、心衰和心肌梗塞等疾病有关。基于环核苷酸在磷酸二酯酶的作用下，产生为1－磷酸腺苷产物后，通过肌激酶（myokinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase）系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值的变化（340nm 波长），来定量分析磷酸二酯酶的总活性。磷酸二酯酶连续循环反应系统为：

产品内容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI缓冲液（Reagent C）   毫升

YIJI反应液（Reagent D）   微升

YIJI酶促液（Reagent E）        微升

YIJI底色液（Reagent F）    微升

YIJI阴性液（Reagent G）    微升

产品说明书  1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；YIJI底色液（Reagent F）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

台式离心机：用于样品操作

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的YIJI裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备
• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过ye
• 次日从液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入置于冰槽里的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 
• 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
• 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
• 测定准备
• 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长340nm，间隔60秒，读数15次（共15分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；YIJI底色液（Reagent F）避免光照
• YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
• 背景对照测定
• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－15分钟读数）
• 样品测定
• 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入10微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－15分钟读数） 

五、计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent D）到相应孔里
• 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent E）到相应孔里
• 分别加入xx微升YIJI底色液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数
• 活性计算

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 样品中避免使用EDTA和EGTA等
• 加样后3秒内光度测定
• 测定值由高到低变化；测定持续15分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于15分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1） 
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 磷酸二酯酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够水解1微摩尔环核苷酸（cAMP或cGMP）至5’-核苷（5’-nucleotides）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列磷酸二酯酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感