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恒远告诉大家：关于WB实验的常见问题以及解决方案（3）
阅读：2365 发布时间：2012-9-14
上海恒远生物科技有限公司是一家生物技术企业，主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发、销售。并代理销售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家国外，致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供*的科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。
22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
23、蛋白变性后可以存放多久？
答：－80℃，一两年没有问题。zui关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。
27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上样量？
答：a）可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b）用5倍的上样缓冲液来稀释变性
30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载。
答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。
22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
23、蛋白变性后可以存放多久？
答：－80℃，一两年没有问题。zui关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。
27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上样量？
答：a）可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b）用5倍的上样缓冲液来稀释变性
30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载。
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