四环素快速检测试剂盒说明书
一、原理
本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物四环素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗四环素抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值与其所含残留物四环素的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物四环素的含量。
二、试剂盒特性
- 试剂盒灵敏度： 0.05ppb
u | 孵育温度： | 25℃ |
u | 孵育时间： | 30min～15min |
u | 样本检测下限 |
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鸡肉样本： |
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四环素 ··········································· | 0.4ppb |
二甲按胺四环素 ·································· | 0.4ppb |
吡四环素 ········································ | 0.4ppb |
金霉素 ········································ | 0.4ppb |
脱甲基金霉素 ································· | 1.2ppb |
土霉素 ·········································· | 0.8ppb |
强力霉素 ······································· | 1ppb |
猪肉、蜂蜜样本： |
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四环素 ·········································· | 0.5ppb |
二甲按胺四环素 ································· | 0.5ppb |
吡四环素 ······································ | 0.5ppb |
金霉素 ········································· | 0.5ppb |
脱甲基金霉素 ································ | 1.5ppb |
土霉素 ··········································· | 1ppb |
强力霉素 ········································ | 1.2ppb |
- 交叉反应率
四环素 ·········································· 100%
二甲按胺四环素 ································· 125%
吡四环素 ······································· | 110% |
金霉素 ··········································· | 100% |
脱甲基金霉素 ··································· | 35% |
土霉素 ············································ | 58% |
强力霉素 ········································· | 45% |
- 样本回收率
鸡肉、猪肉、蜂蜜 ···························· 85±20%
三、试剂盒组成
1 | 微量测试孔 | 每条 8 孔，一板 12 条 | |
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2 | 标准品浓缩液 | 1ml | 黑色帽 |
（81ppb） | |||
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3 | 高浓度标准品 | 1ml | 黑色帽 |
（100ppb） | |||
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4 | 酶标记物 | 7ml | 白色帽 |
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5 | 抗体工作液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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7 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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8 | 终止液 | 7ml | 黄色帽 |
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9 | 20X 浓缩洗涤液 | 15ml | 白色帽 |
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10 | 10X 样本提取液 | 50ml*2 | 透明帽 |
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11 | 标准品复溶液 | 15ml*2 | 蓝色帽 |
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四、所用仪器、试剂
具备的仪器：酶标仪、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒温箱
微量移液器：单道 20～200µl、单道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
试 剂：甲醇
五、样本前处理步骤
- 样本处理前须知
（a）实验中必须使用一次性吸头，吸取不同试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，
必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实 | 3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 | |||||
验结果。 | 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 | |||||
u | 样本前处理需配制： | 程序中的要点。 |
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配液 1 | 样本提取液 A | 4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜 | ||||
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| 用去离子水450ml 与50ml 10X 样本提取液 | 盖住微孔板。 |
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| 混匀或按 9：1 的比例按需配制（如 10X | u 操作步骤： |
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| 样本提取液有结晶，需溶解后在进行稀 | 1、从 2～8℃冷藏环境中取出所需试剂，室温（20～ | |||
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| 释）。 | 25℃）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使 | |||
配液 2 | 样本提取液 B | 用前均须摇匀。 |
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| 取甲醇 50ml 与 450ml 样本提取液 A 混匀 | 2、配制标准品 |
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| 或按 1：9 的比例按需配制。 | 标准品 6：50µl 标准品浓缩液（81ppb）用 950µl | |||
配液 3 | 样本提取液 C | 标准品复溶液稀释 | 4.05ppb | |||
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| 取甲醇 100ml 与 270ml 样本提取液 A 混匀 | 标准品 5：600µl 标准品复溶液与 300µl 标准品 6 | |||
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| 或按 10：27 的比例按需配制。 | 混合 | 1.35ppb | ||
u | 样本处理： | 标准品 4：600µl 标准品复溶液与 300µl 标准品 5 | ||||
（a）鸡肉处理方法 | 混合 | 0.45ppb | ||||
1、称取 1±0.05g 均质后的样本于 50ml 离心管中， | 标准品 3：600µl 标准品复溶液与 300µl 标准品 4 | |||||
| 加入 8ml 样本提取液 A（见配液 1），振荡 3min， | 混合 | 0.15ppb | |||
| 室温 4000r/min 以上，离心 10min； | 标准品 2：600µl 标准品复溶液与 300µl 标准品 3 | ||||
2、取 50 上清液用于分析 | 混合 | 0.05ppb | ||||
| 样本稀释倍数: 8 倍 | 标准品 1：标准品复溶液 | 0ppb | |||
（b）猪肉处理方法 | 3、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放 | |||||
1、称取 1±0.05g 均质后的样本于 50ml 离心管中， | 入自封袋，保存于 2-8℃。 |
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| 加入 10ml 样本提取液 B（见配液 2），振荡 3min， | 4、配液：将 15ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去 | ||||
| 室温 4000r/min 以上，离心 10min； | 离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份 | ||||
2、取 50 µl 上清液用于分析 | 去离子水），或按所需用量配制洗涤液。 | |||||
| 样本稀释倍数: 10 倍 | 5、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每 | ||||
（c）蜂蜜处理方法 | 个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和 | |||||
1、 称取 1±0.05g 均质后的样本于 50ml 离心管中， | 样本孔所在的位置。 |
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| 加入10ml 样本提取液C（见配液3），振荡3min， | 6、加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 | ||||
| 室温 4000r/min 以上，离心 10min； | 加入酶标记物 50µl/孔再加入抗体工作液 50µl/ | ||||
2、 取 50 µl 上清液用于分析 | 孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境 | |||||
| 样本稀释倍数: 10 倍 | 中反应 30min。 |
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| 7、将孔内液体甩干，用已稀释的洗涤液 250µl/孔 | |||||
六、酶标免疫分析程序: | ||||||
洗板 4～5 次，每次间隔 15～30 秒，用吸水纸 | ||||||
u | 测定前应须知： | |||||
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1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温 | 拍干（拍干后未清除的气泡可用干净的枪头刺 | |||||
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（20～25℃）。 | 破）。 | |||||
8、显色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B | ||||||
2、 使用之后立即将所有试剂放回 2～8℃。 | ||||||
液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显 | ||||||
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色 15min。
9、测定：加入终止液 50µl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630n m 检测，5min 内读数），测定每孔 OD 值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含四环素量成负相关。
1、粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为 0.3，样本 2 的吸光度值为 1.0，标准液吸光度值分别是：
0ppb 为 2.243；0.05ppb 为 1.816；0.15ppb 为 1.415； 0.45ppb 为 0.74；1.35ppb 为 0.313；4.05ppb 为 0.155。
则样本 1 的浓度范围是 1.35ppb～4.05ppb；样本 2
的浓度范围是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0 标准）的吸光度值，再乘以 100%，即
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以四环素标准
品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中四环素实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。
八、 注意事项
1、室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20～
25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能变质。
8、该试剂盒理想反应温度为 25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
1、储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。
2、保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见包装盒。
提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
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