孕酮快速检测试剂盒使用说明书

【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物孕酮和微孔条上预包被的偶联抗原竞争孕酮抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物孕酮的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物孕酮的含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.1ppb

检测时间：75min

样本定量检测下限

组织（虾、鱼）……………………………………0.1ppb

猪肉/肝 鸡肉/肝 …………………………………… 1ppb

饲料………………………………………………… 4ppb

奶液…………………………………………………1ppb

交叉反应率

孕  酮………………………………………………100%

雌二醇……………………………………………< 0.1%

雌三醇…………………………………………… < 0.1%

样本回收率

饲  料……………………………………………90±10%

组  织……………………………………………85±10%

奶  液……………………………………………70±10%

【试剂盒组成】  

1、微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1 ppb、 0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1 ppb

3、高浓度标准品：×1瓶：（1ml/瓶） 100ppb

3、酶标记物    12ml………………………………红色帽

4、抗体工作液    7ml………………………………蓝色帽

5、底物液 A液   7ml………………………………棕色帽

6、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

7、终 止 液         7ml……………………………… 黄色帽

8、20X浓缩洗涤液  40ml…………………………白色帽

9、2X浓缩复溶液   50ml…………………………蓝色帽

【所用仪器、试剂】  

仪器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

试   剂：乙腈、正己烷、氯化钠

【实验前溶液配制】

配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓

              缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

配液2、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照

             1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按

            所需用量配制洗涤液。

【样本前处理步骤】  

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

（a）饲料样本

1、 称取2±0.05g捣粹后的饲料样本，加入8ml乙腈，振摇5min，15℃，4000r/min以上，离心10min；

2、 取2ml上清液，60℃氮气/空气吹干；

3、 用1ml正己烷溶解干燥的残留物，加入1ml稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心10min，

不同样本按如下方法稀释：

配合料：取50µl，加入450µl稀释后的复溶液，涡动混匀30s，取50µl 用于检测。

浓缩料/预混料：取50µl，加入950µl稀释后的复溶液，涡动混匀30s，取50µl 用于检测。

配合料稀释倍数：20      

浓缩料、预混料稀释倍数：40

（b）组织（鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼）

1、 称取2±0.05g匀浆后的样本，加入1克氯化钠和6ml乙腈，振摇5min，15℃，4000r/min以上，离心10min。

2、 取3ml上清液，60℃氮气/空气吹干。

3、 用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，

不同样本按如下方法稀释：

      虾鱼：直接取50µl下层水相用于检测。

      猪肉/肝、鸡肉/肝：取50µl下层水相加入450µl稀

      释后 的复溶液，涡动混合30s；取50µl用于检测。

      样本的稀释倍数：

      虾鱼稀释倍数：1      

      猪肉/肝、鸡肉/肝稀释倍数：10

（c）牛奶高检测限处理方法；

1、 取2ml奶液到离心管中，加入3克氯化钠，和6ml乙氰，强烈振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min，直至清亮；

2、 移取3ml上清液至干净的试管中，60℃氮气/空气吹干；

3、 用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心10min;

4、 取50µl下层水相用于检测分析。

      样本的稀释倍数：1

（d）牛奶低检测限处理方法；

1、 直接取50µl牛奶+450µl稀释后的复溶液混合30s；

2、 取50µl用于检测分析。

       样本稀释倍数：10

【酶标免疫分析程序】  

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。取出将孔内液体甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

7、 显色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。

【结果判定】  

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含孕酮成负相关。

1、粗略判定

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310， 样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；0.1ppb为1.320；0.3ppb为1.030；0.9ppb为0.660； 2.7ppb为0.389；8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb； 样本2的浓度范围是0.3 ppb-0.9 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中孕酮实际含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以孕酮浓度（ng /ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孕酮实际含量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）  

3、标准曲线

B/B0 (%)

                                     孕酮(ppb) [µg/kg]

                        图1：孕酮检测试剂盒的回归曲线

4、再现性

%CV

                         孕酮(ppb) [µg/kg]

               图2：孕酮检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出孕酮检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应孕酮浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】  

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

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