海藻糖合成酶（TS）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4950

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用取一瓶前先加入7 mL蒸馏水，震荡使其充分溶解（若溶解后的试剂中有黑色颗粒物，可离心后取上清使用），用不完的试剂2-8℃保存2周。

2、 工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四1:1等体积混合，根据样本实际所需用量现配现用。

3、 标准品：临用前加入1 mL蒸馏水配制成50 μmol/mL的麦芽糖标准溶液，用不完的试剂2-8℃保存2周。然后用蒸馏水16倍稀释成3.125 μmol/mL的麦芽糖标准溶液（建议吸取25μL 50μmol/mL麦芽糖标准溶液，加入375μL蒸馏水中，充分混匀）待测，现用现配。

产品说明：

海藻糖是功能性低聚糖，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结性等特性，是细胞在不良环境条件下产生的一种重要的抗逆应激物之一，它对生物大分子和生物组织有着非特异性的保护作用。

海藻糖合成酶（Trehalose Synthase，TS）能催化麦芽糖生成海藻糖，是海藻糖生物合成的关键途径之一。本试剂盒使用糖化酶分解剩余麦芽糖为葡萄糖，通过葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量，按照麦芽糖减少的量表示海藻糖合成酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液枪、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（功率200W，超声3s，间隔9s，重复30次）；然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待检。

组织：按照组织质量（g）: 提取液体积（mL）为1 : 5~10 的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液），进行冰浴匀浆。8000 g，4℃，离心10 min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤，置于冰上待检。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至505 nm，蒸馏水调零。

2、 在EP管中进行如下操作：

（1）酶促反应

（2）显色反应（在EP管中进行以下操作）

注：空白管和标准管只需测1~2次。

三、酶活性计算

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活（U/mg prot）= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷（V样×Cpr）÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F

2、按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活（U/g 质量）= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷（V样÷V样总×W）÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

3、按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟催化1 nmol 麦芽糖生成1 nmol 海藻糖定义为一个酶活力单位。

TS酶活（U/10⁴ cell）= C标×ΔA测定÷ΔA标准×V样÷（V样÷V样总×cell）÷T×F÷2

=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷cell×F

 C标：标准管浓度，3.125 μmol/mL=3.125×10³ nmol/mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：加入样本体积，0.1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；cell：细胞或细菌总数，以万计；F：稀释倍数； 2：1分子麦芽糖可转化为2分子葡萄糖。

注意事项：

1、 当吸光值大于1.5或者ΔA测定大于1时，建议将样本用蒸馏水稀释后测量。计算公式注意乘以稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1 g小鼠肝脏加入1 mL提取液进行匀浆研磨，取上清用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用1 mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A对照-A测定=1.471-0.817=0.654、ΔA标准=A标准-A空白=0.790-0.003=0.787，按样本质量计算酶活得：

TS酶活（U/g 质量）= 13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =216.393 U/g 质量。

2、 取0.1 g海带加入1 mL提取液进行匀浆研磨，取上清用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用1 mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A对照-A测定=1.059-0.629=0.430、ΔA标准=A标准-A空白=0.790-0.003=0.787，按样本质量计算酶活得：

TS酶活（U/g 质量）=13.02×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =142.277 U/g 质量。

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