亚铁离子含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5410

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 标准品：10mg FeSO₄·7H₂O，临用前加入900μL蒸馏水和20μL浓硫酸，充分混匀，配制成40 mmol/L标准液，2-8℃可保存2周。

产品说明：

铁是人体必需的微量元素之一，对于维持机体正常生理功能具有重要作用。亚铁离子是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其他酶系统的重要组成成分，帮助氧的运输，促进脂肪氧化。缺乏铁元素容易造成贫血、代谢紊乱，并影响机体的免疫功能。铁过量是引发或加剧多种慢性病（如糖尿病、心脑血管疾病、神经退化性疾病等）的危险因素。

样本中的Fe²⁺在酸性条件下与三吡啶基三嗪形成蓝色配合物，在593nm处有吸收峰，通过测定该波长吸光度即可计算Fe²⁺的含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、涡旋震荡仪、冰、蒸馏水、浓硫酸和氯仿。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若有浑浊请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至593nm，蒸馏水调零。

2. 标准溶液的稀释：取10μL 40 mmol/L标准液，加入990μL蒸馏水，混匀得到400 μmol/L标准液，将400 μmol/L标准液用试剂一进行稀释得到100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μmol/L的标准液备用，注意标准溶液需要现用现配。

3. 标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需800µL标准液。

4. 在1.5mL离心管中按下表步骤加样：

三、亚铁离子含量计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/L）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/L）。

2. 亚铁离子含量的计算：

（1）按血清（浆）等液体体积计算：亚铁离子含量（μmol/L）=x

（2）按样本蛋白浓度计算：亚铁离子含量（μmol/mg prot）=x×10^-3×V提取÷（Cpr×V提取）=0.001x÷Cpr

（3）按样本质量计算：亚铁离子含量（μmol/g 质量）=x×10^-3×V提取÷W=0.001x÷W

（4）按细胞/细菌数量计算：亚铁离子含量(μmol/10⁶ cell)=x×10^-3×V提取÷N= 0.001x÷N

V提取：加入试剂一的体积，1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计；10³：单位换算系数，1μmol/L=10^-3μmol/mL。

注意事项：

1. 用试剂一稀释得到的标准液容易失效，建议现用现配。

2. 如果∆A测定过低或测定管吸光值接近空白管，可以增加样本量后再进行测定；如果∆A测定大于1，建议将样本用试剂一适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例： 

1、 取0.1026g小鼠肝脏样本，加入1mL试剂一，冰浴匀浆，离心后取上清按照测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.315-0.01=0.305，根据标准曲线y=0.0104x-0.008，R²=0.9948，计算x=30.096，按样本质量计算：

亚铁离子含量（μmol/g 质量）=0.001x÷W =0.293 μmol/g 质量。

2、 取800μL牛血清，按照测定步骤操作，使用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.400-0.01= 0.390，根据标准曲线y=0.0104x-0.008，R²=0.9948，计算x=38.269，按液体体积计算：

亚铁离子含量（μmol/L）=x=38.269 μmol/L。

参考文献：

[1] Dong C, Yang M, Wang W. Study on spectrophotometric determination of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) with 2, 4, 6- tri(2′-pyridyl)-1, 3, 5-triazine. [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2004, (01):76-78.

[2] Huang Y, Ma H, Xu J, et al. Development and Validation of Reference Methods for Determination of Serum iron. [J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2011, 15(03):453-457.

[3] Wang H, Liu B, Ding Z, et al. Ferene method flow injection analysis as optimized in situ analysis of dissolved iron in marine waters. [J]. Marine Sciences, 2016, 40(05):82-87.

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