细胞铜（Cu）含量检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5750

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：若有试剂析出，置于37℃水浴溶解即可。

2. 标准品：10mmol/L（即10000nmol/mL）硫酸铜标准液。

3. 20nmol/mL标准品配制：将10000nmol/mL标准液用蒸馏水先稀释为200nmol/mL的标准溶液，再将200nmol/mL标准液稀释为20nmol/mL的标准液备用，具体稀释可参考以下：取20µL 10000nmol/mL的标准液加入980µL蒸馏水混匀，即为200nmol/mL的标准品；再吸取100µL 200nmol/mL的标准液加入900µL蒸馏水混匀，即为20nmol/mL的标准品。 

产品说明：

铜（Cu）是人体必需的微量元素之一，也是蛋白质以及酶的重要组成部分。可以存在于红细胞的内外，主要功能是辅助造血，即催化血红蛋白的合成。铜元素可以适当促进人体的骨骼发育，促进人体神经系统以及脑部发育，维持婴幼儿的正常生长发育，因此，测定组织内铜离子含量可知体内是否缺铜。

酸性条件下，Cu²⁺从铜蓝蛋白和清蛋白中解离出来，与络合剂3,5-二溴-PAESA反应，产生紫色络合物，在580nm处有特征吸收峰，在一定范围内吸光度与浓度成正比，从而计算出Cu²⁺浓度。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细胞的处理：收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（10⁶个）：蒸馏水体积（mL）为5~10：0.4的比例（建议5百万细胞加入0.4mL蒸馏水），超声波破碎细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔7s，共3min），然后10000g，4℃，离心10min，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至580nm，蒸馏水调零。

2、 实验前根据样本量取部分试剂一37℃预热10min。

3、 操作表：（在1.5mLEP管中依次加入以下试剂）

三、细胞铜（Cu）含量的计算

1. 按细胞数量计算

细胞铜（Cu）含量（nmol/10⁶ cell）= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷N =8×ΔA测定÷ΔA标准÷N

2. 按蛋白浓度计算：

细胞铜（Cu）含量（nmol/mg prot）= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷（Cpr×V提取）

= 20×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

C标准：标准品浓度，20nmol/mL；V提取：试剂一体积，0.4mL；N：细胞总数，以百万计；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1. 37℃孵育5min后请立即测定吸光度，若样本数量过多，可分批次测定，尽量确保在20min内完成测定。

2. 如果样本测定吸光值大于0.5，建议将样本用蒸馏水稀释后进行测定，注意同步修改计算公式。

3. 如果样本测定吸光值小于0.005或接近空白管吸光值，可适当增大样本量，空白管和标准管也需要进行相应调整。

实验实例：

1. 收集约5百万SHSY5Y细胞，加入0.4mL蒸馏水，超声波破碎（功率 200w，超声3s，间隔7s，共3min），10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.187-0.071=0.116，ΔA标准=A标准-A空白=0.441-0.071=0.370，按细胞数量计算铜含量得：

细胞铜含量（nmol/10⁶ cell）= 8×ΔA测定÷ΔA标准÷N=0.5016 nmol/10⁶ cell。

2. 收集约5百万U937细胞，加入0.4mL蒸馏水，超声波破碎（功率 200w，超声3s，间隔7s，共3min），10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。之后按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.129-0.071=0.058，ΔA标准=A标准-A空白=0.441-0.071=0.370，按细胞数量计算铜含量得：

细胞铜含量（nmol/10⁶ cell）= 8×ΔA测定÷ΔA标准÷N=0.2508 nmol/10⁶ cell。

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