线粒体复合体Ⅱ活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC3230
规格：25T/24S、50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

25T溶液的配制：
试剂二：临用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存2个月；
试剂二工作液：临用前根据样本量将试剂二：丙 酮=10μL:1mL（约20T）混合备用，现用现配；
试剂三：临用前加入1mL丙  酮，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装可保存4周，注意封口；
工作液的配制：临用前根据样本量将丙 酮：试剂二工作液：试剂三=0.25mL：0.5mL：0.25mL（1mL，约10T）混合备用，现用现配。
50T溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入0.1mL丙 酮，丙 酮 易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存2个月；

2. 试剂二工作液：临用前根据样本量将试剂二：丙 酮=10μL:1mL（约20T）混合备用，现用现配；

3. 试剂三：临用前取1支加入1mL丙 酮，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装可保存4周，注意封口；

4. 工作液的配制：临用前根据样本量将丙 酮：试剂二工作液：试剂三=0.25mL：0.5mL：0.25mL（1mL，约10T）混合备用，现用现配。

产品说明：
线粒体呼吸链复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD还原为FADH₂，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙 酮、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体的操作步骤请见“产品资料"文件

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值大于1.2，可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.6，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去重悬试剂（提取液一+提取液二）本身的蛋白含量（约0.5mg/mL）。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，另附按样本质量计算公式和按细胞数量计算公式

4. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为50T/24S） 

A、上清中复合体Ⅱ活性的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性（U/g 质量）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V提取×V样) ÷T =190.5×ΔA1÷W
B、沉淀中复合体Ⅱ活性的计算:
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性（U/g 质量）= [ΔA2×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷ (W÷V重悬×V样) ÷T=76.2×ΔA2÷W
C、样本复合体Ⅱ总活性的计算：
样本复合体Ⅱ总活性即为上清中复合体Ⅱ活性与沉淀中复合体Ⅱ活性之和。
复合体Ⅱ总活性（U/g 质量）=190.5×ΔA1÷W +76.2×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：样本匀浆加入提取液一的体积，1mL；V重悬：沉淀重悬加入提取液一和提取液二的总体积，0.4mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，5min；W：样本重量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1. 附：使用细胞数量计算公式：（样本检测数为50T/24S） 

A、上清中复合体Ⅱ活性的计算：
单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V提取×V样) ÷T =190.5×ΔA1÷N
B、沉淀中复合体Ⅱ活性的计算:
单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V反总÷（ε×d）×10⁹] ÷ (N÷V重悬×V样) ÷T=76.2×ΔA2÷N
C、样本复合体Ⅱ总活性的计算：
样本复合体Ⅱ总活性即为上清中复合体Ⅱ活性与沉淀中复合体Ⅱ活性之和。
复合体Ⅱ总活性（U/10⁶ cell）=190.5×ΔA1÷N +76.2×ΔA2÷N
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，10^-3L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：样本匀浆加入提取液一的体积，1mL；V重悬：沉淀重悬加入提取液一和提取液二的总体积，0.4mL；V样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，5min；N：细胞数量，以10⁶ 计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
相关发表文献：

1. Qiuli OuYang, Nengguo Tao, Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. February 2018;(IF4.259)

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

3. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury- induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

参考文献：

1. Mühling J, Tiefenbach M, López-Barneo J, et al. Mitochondrial complex II participates in normoxic and hypoxic regulation of α-keto acids in the murine heart[J]. Journal of molecular and cellular cardiology, 2010, 49(6): 950-961.

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