丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1070

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液：内含不溶物，使用前摇匀。

2、 试剂一的配制：临用前配制，将试剂一B、试剂一C加入到试剂一A中并充分溶解。-20℃分装保存，可保存4周，避免反复冻融。

3、 试剂二B：临用前加入0.6mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

4、 试剂二C：临用前加入1mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

5、 试剂二的配制：临用前配制，取2.625mL试剂二A、0.225mL试剂二B、0.15mL试剂二C混合（共3mL，约30T），现用现配。

产品说明：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH在340nm有吸收峰，而NAD⁺没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品

台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 根据样本数取适量试剂一、试剂三37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴提前预热30min。

3、 操作表：

在比色皿中加入上述试剂后迅速混匀后于340nm比色，记录10s和70s的吸光值，测定管的记为A1和A2，空白管的记为A3和A4，计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做1-2次）

三、PDC活性计算

1、血清（浆）PDC活力的计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mL）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷V样本÷T=1.6×ΔA

2、 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mg prot）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷(V样本×Cpr)÷T=1.6×ΔA÷Cpr

3、按样本质量计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每g组织质量在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷ (W÷V提取×V样本)÷T=1.6×ΔA÷W

4、细菌或细胞中PDC活力的计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol的NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/10⁴ cell）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷(V样本÷V提取×N)÷T=1.6×ΔA÷N

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1mL=0.001L；V样本：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；10⁶：单位换算系数，1mol=10⁶μmol；N：细胞或细胞数量，以万计。

注意事项：

1、 实验时，试剂二和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4、 如果1分钟变化值较小可延长反应时间，同时注意修改计算公式。

实验实例：

1、 取0.1g绿萝叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清，之后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.945-0.93）-（0.716-0.714）=0.013，按样本质量计算酶活得：

PDC（U/g 质量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.013÷0.1=0.208 U/g 质量。

2、 取0.1g小鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清用蒸馏水稀释40倍后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）=（0.602-0.322）-（0.716-0.714）=0.278，按样本质量计算酶活得：

PDC（U/g 质量）=1.6×ΔA÷W=1.6×0.278÷0.1×40（稀释倍数）=177.92 U/g 质量。

相关发表文献：

Chong Li, Shi Gao, Xiaotong Li, et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018; (IF5.452)

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