本试剂盒必须在-20℃下避光保存，有效期为6个月。

1.         DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10,000rpm离心5min，弃去上清；加入50µL DNA提取液，充分混匀后沸水浴5 min，13,000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。

2.1.        从试剂盒中取出PCR反应液，冰盒上融化后混匀。试剂在使用前2000rpm离心20s备用。

2.2.        设需要的PCR反应管管数为N（N = 待检样本数+ 1管阴性对照 +1管阳性对照）。

2.3.        混合液的配制：先吸取体积为22.6（µL）×N反应液1.5mL灭菌离心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N，混匀后2000rpm离心20s，然后向N 个0.2mL PCR反应管中分装已加入Taq酶的混合液23µL/每管，盖紧管盖。

2.4.        注意：阴性对照管建议在此区中加入2µL阴性对照样品。

3.1.        阳性对照取出解冻，使用前2000rpm 离心20s。

3.2.        将保存在-20℃的核酸提取物置室温解冻，以13,000rpm离心5min；向N个PCR管中分别加入待检样本DNA（包括阳性对照）2µL，盖紧管盖，2000rpm离心20s，将PCR反应管转移核酸扩增区。注意做好样品号标记。

4.1.        上机前应检查各反应管是否盖紧。

 反应体系设为25µL；荧光信号采集设定在退火温度。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道。

 PCR循环参数为：*阶段，95℃  3 min预变性；

第二阶段，[95℃ 15s；55℃ 40s；72℃ 15s] × 40次循环

注意：在的LightCycler上使用，变性温度95℃改为93℃，其他不变。

5.1   综合分析仪器给出的各项数据及扩增曲线，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），使仪器给出正确的结果。

5.2   阴性对照C_T值应显示为0或≥40.0，阳性对照的C_T值应≤30.0，否则视实验失败，需重做。

5.3   检测样品C_T≤35.0，结果有效，可直接报告样品阳性。

 

5.4   检测样品35.0<C_T>40.0，需进行一次重复实验，若C_T仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。

5.5   检测样品C_T值为零，报告样本阴性。

l         Cepheid公司的SmartCycler

l         ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列

l         Stratagene公司的MX3000、MX4000

l         Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000

l         Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2

l         公司的LightCycler等

1.         本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。

2.         请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作。

3.         PCR实验严格分区操作；各区应有的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。