之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11，?要?启动子T5promotor 的启动受到?好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15[pREP4]。 M15[pREP4] 可持续表现lac repressor，pQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大?表现。 在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M15[pREP4] 菌体抽取total RNA，以?以?方杂合反应分析GUS mRNA的表现情形。 下面所采用的方法适用于大肠杆菌及其他革?氏阴性菌total RNA的抽取，实验进?时先以lysozyme 分解细胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）?解原生质膜 （Summers, 1970; Ausubel et al., 2005）；的后加入适?的氯化钠溶液将SDS、蛋白质及大肠杆菌的染色体DNA 一并沉淀下?，并以离心法移除，存?于上清液的RNA 则以酒?沉淀。 实验过程所使用的RNase 抑制剂为DEPC。
仪器用具：恒温震荡培养箱37℃；冰浴；微?离心机；分光光?计 （Hitachi U-1100 spectrophotometer）
药品试剂：大肠杆菌菌株pQG11/M15[pREP4];LB 培养液;Ampicillin （100 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （1 M）;Protoplasting buffer （15 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer （10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM NaCl; 1 mM sodium citrate; 1.5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;饱和氯化钠溶液 （以40 g氯化钠溶解于100 mL dH2O/DEPC）;酒?及70%酒?
方法步骤：
大肠杆菌pQG11/M15[pREP4] 的培养：
1） 将pQG11/M15[pREP4] 接种于2 mL含ampicillin （100 μg/mL） 及kanamycin（25 μg/mL） 的LB培养液，于37℃震荡培养过夜。
2） 隔日早晨，取0.5 mL pQG11/M15[pREP4] 过夜培养液，加入25 mL 含有ampicillin （100 μg/mL） 与kanamycin （25 μg/mL） 的LB 培养液，于37℃震荡培养2 h。
3） 加入25 μL 1 M IPTG，继续放置于37℃震荡培养。
4） 经过4 h 后，取出pQG11/M15[pREP4] 培养液，开始进?RNA 制备工作。
制备RNA：注意！进?以下RNA 制备实验时，除?使用依上述步骤所准备的pQG11/M15[pREP4] 培养液外，请记得向助教?取未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液当做对照组。
1） 取出4 支1.5 mL 微?离心管，分别标示为I-1, I-2, U-1 与U-2。
2） 取3 mL 经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微?离心管I-1 与I-2。
3） 取3 mL 未经IPTG 诱导的pQG11/M15[pREP4] 培养液平均分置于微?离心管U-1 与U-2。
4） 以8,000 rpm （4℃） 离心5 min，小心倒掉上清液，并以微?移液器尽?吸掉残?的液体。
5） 各加入0.5 mL protoplasting buffer，以微?移液器将大肠杆菌充分悬浮。
6） 再加入1 mL protoplasting buffer 与12 μL 50 mg/mL lysozyme，混合均匀的后，移置于冰浴中作用15 min。
7） 以7,000 rpm 于4℃离心5 min。
8） 小心倒出上清液，并以微?移液器尽?吸掉残?的液体。
9） 各加入75 μL gram-negative lysing buffer 及2 μL DEPC，以微?移液器小心悬浮沉淀于管底的大肠杆菌原生质体，并离心数秒。 在以微?移液器悬浮大肠菌原生质体时，一旦pellet 被充分打散即应停止悬浮动作，以避免大肠菌DNA 断?可能造成的问题。 DEPC 可能是一种致癌物质，使用时请在抽气橱内操作。
10） 将微?离心管放入37℃恒温水槽作用5 min。
11） 作用完毕的后，将离心管移到冰浴中静置5 min。
12） 加入38 μL 饱和氯化钠溶液，以手指头轻弹管壁，充分混合均匀。
13） 静置于冰浴中作用10 min，此时应有白色沉淀出现。
14） 以13,000 rpm 于4℃离心10 min。
15） 将上清液移至新的微?离心管，并加入0.3 mL 酒?。
16） 混合均匀后将离心管放置于 -20℃过夜，以?沉淀RNA。 RNA 在酒?内相当稳定，?须长期保存，可停在这一步。
17） 以14,000 rpm 于4℃离心15 min。
18） 小心倒掉上清液后，加入300 μL 70%酒?。
19） 以14,000 rpm 于4℃离心5 min 的后，小心倒掉上清液。
20） 将微?离心管倒置于桌面上30 min，以?风干RNA。
21） 将RNA溶解于30 μL dH2O/DEPC。
22） RNA定?：取5 μL RNA，加入995 μL dH2O/DEPC稀释的后，以分光光?计测其在260 nm与280 nm的吸光值 （记得使用石英测光管），并计算RNA的浓?与A260/A280的比值。 RNA溶液在260 nm的吸光值为1.0 时，则浓?相当于40 μg/mL，而其A260/A280的比值应为1.7~2.0 （DNA则为1.8 左右）。 这四个RNA 样本将于后续实验中，分别以甲醛洋菜胶体电泳进?分析