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原位杂交-典型实验方案背景

检测样品:细胞检测项目:原位杂交

方案概述:CEM集团的子公司Intavis 公司从2007年开始向全球推出了适用于全组织和切片标本的自动化原位杂交及免疫组化系列产品。通过对以往型号的大幅改进,使得InsituPro 更加满足用户的需求并使得用户对实验的应用更加高效。

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更新时间2022年08月05日

上传企业培安有限公司

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原位杂交1.jpg

 

复水(有时候也用到脱水,只是顺序相反)

温度:环境

描述:通过一系列的缓冲液交换将样品从在100% 甲醇或乙醇的储存条件中转移到水缓冲液中。通常从100%的乙醇交换到75%、50%、25%、0%,每次交换后留5 min进行平衡即可。如脱水进行太快或不进行脱水,样品形态将被破坏,甚至被撕成碎片。

漂白(可选

温度:环境

描述:通常与3%的过氧化氢孵育,以摆脱内部的过氧化物酶和漂白暗色的胚胎

 

烷基化(可选,INTAVIS仪器不能完成)

温度:环境

描述:三乙醇胺中的乙酸酐用于使组织带负电荷,从而降低背景。它被广泛应用,特别是在植物领域,用极少的探针就可以增强结果。

自动化时:乙酸酐在溶液中非常不稳定,它在制备后能用于孵育的时间不超过一分钟,因此不可能实现自动化(并且探针通常不需要)。

原位杂交3.jpg

 

细胞壁消化(可选,只在植物中)

温度:环境

描述:植物样品中主要使用盐酸水解细胞壁。或者如崩溃酶和纤维素酶等酶类也能被使用。

 

渗透(时间要求严格)

温度:环境或37℃

描述:使探针能接触样品组织至关重要。这步处理通常使用蛋白酶,主要是蛋白酶K,但链霉蛋白酶和其他蛋白酶也能被使用。但也有其他的处理方法,如热处理(蒸汽)或与洗涤剂混合物孵育。对于蛋白酶K,甘氨酸通常被用来立即停止蛋白酶K的作用,或者通过数次换液将蛋白酶K 洗掉。渗透后,通常会使用多聚甲醛进行固定。

自动化时:所有蛋白酶应足够稳定,到使用前不会自我分解,如蛋白酶K。

 

杂交

温度:通常50-70℃(RNAse 在37℃)

描述:杂交由几步组成:

1,预杂交步骤(可选)逐步交换杂交 缓冲液,并封闭非特异结合位点

2,杂交步骤,与探针孵育

3,杂交后洗涤步骤,用越来越严格的缓冲液进行多次洗涤

4,通常在杂交后洗脱步骤之间,进行RNAse消化(可选)来摆脱未结合的探针减少背景:RNAse缓冲液洗涤,用RNAse处理,再次RNAse缓冲液洗涤,所有步骤在37℃进行。

5,更多的杂交后洗涤

原位杂交2.png

 

抗体孵育

温度:环境或更低

描述

在此步骤中,抗体与探针上的抗原结合

1. 用封闭试剂封闭(如Roche 封闭试剂,BSA,山羊或绵羊血清)。在这一步,所有非特异抗体结合位点将被蛋白饱和

2, 与抗体孵育,让抗体抗原结合

3, 洗涤步骤,洗涤未结合抗体

自动化时:由于基本上所有检测探针的抗体都是商业化的,它们室温下工作并具有相同的特异性。抗体结合在室温下更快结合。

 

与碱性磷酸酶缓冲液孵育(如NTMT

温度:环境

描述:与新鲜制备的缓冲液孵育,为碱性磷酸酶颜色反应做准备

自动化时:使用碱性磷酸酶偶联抗体时,缓冲液储存过久或使用前制备时会沉淀。

 

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