绵羊粘蛋白13(MUC13) ELISA 试剂盒

试剂盒局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
试剂盒性能
1、灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2、特异性：不与其它细胞因子反应。
3、重复性高：板内、板间变异系数均小于10%。

如何保证ELISA试剂盒的质量
办法学的影响
ELISA测定模式包含以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞赛抑制法，其中竞赛抑制法(HBeAb,HBcAb等采用)因受操作时差所引起的平竞赛等要素的影响，成果重复性较差，质量较难控制。
第二、试剂要素
不同批次的ELISA试剂在制造进程中很难确保质量一致，即使是经过批批检的项目其检测成果也存在差异，因而必须选择和订货长批号的试剂，并确保保存条件。严厉执行这一规范可以防止因试剂批号改动而从头树立质控系统及从头评估试剂的杂乱进程，并且可以确保成果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装部分即可，防止重复冻融造成试剂的失效。
第三、样本要素
标本搅扰要素包含内源性搅扰要素和外源性搅扰要素，ELISA试剂盒前者包含类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、等，后者包含标本溶血、标本被细菌污染、标本储存时间过长、标本凝结不全、冷冻标本的重复冻融等。
第四、操作要素
ELISA操作步骤杂乱，操作不当将引起较大的误差。加样、温育、洗涤、显色、比色。
第五、灰区的设置
通常情况下，ELISA定性实验以“阳性”和“阴性”来陈述成果，两者间有一条分界线被称为
“阳性判断值”(cut-off value，CO值)，这是定性免疫测定成果陈述的依据。

第六、标本复查
ELISA手工检测进程杂乱，影响要素较多，即使室内质控在控，也可能因孔间差异而造成成果的差异，因而加大复查力度是确保成果准确性的牢靠办法，比如对HBsAg、HBeAg、HCV-Ab、HIV-Ab、TP-Ab等项目的可疑、弱阳性标本及罕见模式的检测成果进行复查。
第七、常表明成果的常用办法
1.定性测定
2.半定量测定 成果一般以滴度表明。
3.定量测定 即用已知量的规范品作一系列稀释后进行ELISA测定，制作规范曲线，成果以jue对量或单位表明。在ELISA试剂盒定量检测中每一块反应板都必须制作相应的规范曲线。
不按说明书操作会造成的后果
   
每一个试剂盒里都会有对应的说明书，注意事项里大多都会提到“实验严格按照说明书的操作进行”。为什么要严格按照说明书操作？为了更完整的回答这个问题，需要先回顾一下ELISA各种方法的原理。
根据试剂的来源和标本的性状及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法。大致分为以下几类：
1.双抗体夹心法测抗原
2.双抗原夹心法测抗体
3.竞争法测抗原
4.间接法测抗体

总结如果不按说明书操作可能会出现的不满意结果。
A. 先说最严重的操作错误，看错或压根不看试剂盒配套说明书，不按操作步骤加样。比如把竞争法的试剂盒当作双抗体夹心法来做，导致的结果就是整板显示很强的蓝色，无任何梯度。
B. 混用别的试剂盒里的试剂。不同厂家或者相同厂家的不同试剂盒，所含的试剂成分很可能是不一样的，混用导致的结果是，浪费珍贵的样本，样品的回收率达不到预期值，如果混用不同试剂盒的酶复合物，会导致显色过弱或过强，因为每种试剂盒所用酶复合物效价可能不一样。
C. 不看文献或者不做预实验。比如某个试剂盒按照其灵敏度范围和文献报道推算样本应该1:10稀释，结果稀释成1:1000，导致的结果是显色过弱，结果不可用。
D. 不校准移液器及培养箱的温度湿度。导致工作试剂浓度不准确，孵育温度不合适，实验带来误差。
E. 洗涤不充分，每孔洗液加样过少，或者残留。导致的结果是显色过快，同时背景较高。
F. 手洗板时所用枪头没有悬空加入洗液，导致洗液污染，整个实验失败。
G. 剩余酶标板条未及时放入干燥袋，导致酶标板受潮，下一次再做时，显色过弱或污染，CV值过高。




怎么挑选适合自己实验的抗体
一、关于特异性的挑选：
特异性的挑选首要需求考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、试验方法特异性、符号物的特异性。
1、蛋白特异性：
针对需求检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意检查抗体说明书的检测说明。假如重组蛋白不是全长表达，则需求注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。
内源性蛋白能清楚其剪切与润饰的方式，特殊表型的蛋白需求进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，检查穿插反应的状况。磷酸化蛋白检测需求确认具体位点，不同位点的磷酸化意味着或许有不同的机制存在，不宜混为一谈。
2、种属特异性：
同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或规划多肽抗原的，根据蛋白的同源性状况与其他种属发生穿插反应。需求参照说明书注明的可反应种属信息。
一些稀有种属很难找到抗体，可以经过蛋白的序列比对，挑选同源序列免疫的抗体，不过一般这种状况生产商不会受理其关于质量的申述，假如可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体挑选。。
3、符号物的特异性
一般基于试验操作的试验方法不会运用带有符号的一抗，比方WB、IHC等，都是经过二抗类的试剂符号达到成果出现的意图。可是基于仪器剖析的一些试验，或许就会运用到直接符号的一抗，比方流式试验。那么需求了解到自己将要运用的仪器能检测到的荧光规模，针对不通的参数要求挑选对应的符号物。在免疫荧光双标试验中，需求选配不同的荧光符号物。

二、抗体种属来历的挑选：
    有人以为单抗比多抗好，其实这并不是一个严谨的观点，只能说在或许性上单抗的特异性更好一些，而多抗的亲和力会优于单抗，而且特异性并不一定就逊于单抗，首要看抗原的规划水平。
目前商品化抗体里单抗首要是鼠单抗、兔单抗，多抗首要是兔多抗、山羊多抗等，其他种属来历抗体较少。不主张纠结于单抗好还是多抗好，能做出试验的抗体便是好抗体。
在挑选上一般主张试验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。抗体不同种属会要影响接下来二抗的选配。特别是在免疫荧光双标试验中，需求在差异于试验种属的基础上，区分开两个目标的抗体种属来历，以便于二抗差异识别。

三、关于品牌的挑选：
    由于抗体品质的异质化，关于抗体的品牌挑选就被我们所注重，可是不管是什么品牌都难免会遇到不合适自己试验的抗体。所以一般主张考虑那些业界普遍认可、购买方便、专业、售后处理快捷的品牌。
一些乃至都没有正式代理的，只能备选。一起购买时一定要找可以供给产品指导、试验剖析、售后处理的正规代理商购买，防止由于买到假货水货影响试验。
其实或许只是生产商只检测时运用了不同的种属不同的样品类型，或是参照了不同的文献，对运用者来说，相同的样品，不管运用哪个品牌的，只需抗体是对的，意图条带只会出现在相同的位置。

ELISA试剂盒技术流程

技术提示：
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
8、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

试剂盒性能：
1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
2. 批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。

操作注意事项
1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3）不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8）加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
试剂盒试剂的准备
1）标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。
2）洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
试剂盒操作步骤
1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断与分析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

绵羊粘蛋白13(MUC13) ELISA 试剂盒  

本试剂供研究使用      

实验目的：

本试剂盒可用于测定血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液等
自备材料

1）蒸馏水。
2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振荡器及磁力搅拌器等。

试剂盒安全性

1）避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项：

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。样本在使用前也要在室温平衡60分钟。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。