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抗原蛋白 P9 ; 间接 ELISA

1 材料与方法

1. 1 菌株及血清 副鸡禽杆菌 A、B、C 三个血清型

的标准株由本实验室保存。Apg 的 A 型菌、B 型菌

和 C 型单因子鸡血清和 P9 蛋白抗血清分别由对应

菌株或抗原人工接种 SPF 鸡制得， 由本实验室制备

并保存。大肠杆菌 O1、O2、O78亚型以及流感( AI)

H9 亚型、新城疫( ND) LaSota 株( NDLa) 和 F48 株

( NDf48) 、鸡传染性法氏囊病 ( IBD) 、减蛋综合征

( EDS'76) 等禽病病原单因子阳性鸡血清及 SPF 鸡

血清等， 均由本实验室保存或制备， 支原体抗 MG-S6

株阳性血清购自中国兽医药品监察所。120 份临床

样本血清采自河北某蛋鸡场 120 日龄鸡， 该鸡群分

别在 56 日龄和 90 日龄用鸡传染性鼻炎三价灭活疫

苗进行了免疫。

红细胞凝集反应用抗原( HA 抗原) : 副鸡禽杆

菌 A 型( Hp8 株) 、B 型( BJ 株) 和 C 型( 668 株) HA

抗原， HA 效价均为 1∶ 160; 副鸡禽杆菌 A 型阳性血

清、B 型阳性血清和 C 型阳性血清， 红细胞凝集抑

制( HI) 抗体价为 1∶ 80 ～ 1∶ 160; 10% 戊二醛固定的

鸡醛化红细胞， 以及血清稀释液( 含 0. 1% BSA 的

0. 01 mol /L pH 值 7. 0 PBS) ， 以上材料均由本实验

室制备并保存。

1. 2 主要试剂和仪器 酶标板为 NUNC 公司产

品， HＲP 标记兔抗鸡 IgG 抗体产自 Sigma 公司; TMB

显色液产自 KPL 公司; 酶标仪( Molecular Devices，

SPECTＲA MAX190) 。

1. 3 方法

1. 3. 1 抗原蛋白 P9 的制备及纯化 利用生物信息

学软件 Geneious( Biomatters. Ltd，

， 通 过 对 副 鸡 禽 杆 菌 外 膜 蛋 白

HMTp210 的基因( GenBank No． KJ867497) 筛选分

析， 选取氨基酸序列从第 1090 到 1648 的肽段， 命名

为 P9， 由华大基因科技( 北京) 服务有限公司进行全

基因合成并原核表达。通过对 P9 编码基因的 PCＲ

扩增、与表达载体 pET30a 连接等步骤构建重组表

达 质 粒 pET30a-P9。 将 pET30a-P9 转 化 BL21

( DE3) ， 诱导表达后超声裂解上清用镍亲和层析柱

纯化， 获得纯化的 P9 蛋白。

1. 3. 2 阴性血清及 P9 蛋白抗血清的制备 重组抗

原蛋白 P9 与 MONTANIDE ISA 71 VG 佐剂( SEPPIC

公司产品) 按 3 ∶ 7 重 量 比 混 合 乳 化 ( 操作方法见

SEPPIC 公司产品使用方法介绍) ， 使疫苗中抗原蛋

白终浓度为 20 μg /mL， 所制备的疫苗命名为 vP9。

免疫方法: 取 42 日龄 SPF 鸡， 分为 2 组， 30 只 /组。

其中一组为疫苗免疫组， 分别胸部注射所述 vP9 疫

苗 0. 5 mL /只; 另一组为非免疫对照组。第 1 次免

疫后间隔 4 周， 对所有免疫组的鸡进行二次免疫， 剂

量及免疫途径与次免疫相同。所有试验鸡每周

于翅静脉采血 1 次， 分离血清， － 20 ℃ 保存备用。

1. 3. 3 间接 ELISA 方法的建立

1. 3. 3. 1 抗原包被浓度及血清稀释度的选择 采

用棋盘滴定法， 用 0. 05 mol /L 碳酸盐缓冲液( PBS，

pH 值 9. 6) 依次按以下比例稀释 P9 抗原( 0. 5 mg /

mL) : 依次做 50、100、500、1 000、2 000、4 000、8 000、

16 000 倍稀释， 包被反应板 100 μL /孔， 横向包被酶

标板， 4 ℃ 过夜; PBST ( PBS + 1% tween20， pH 值

7. 4) 清洗 3 遍后加入封闭液 ( 5% 脱脂乳， PBS 配

制) ， 37 ℃ 封闭 2 h， PBST 清洗 3 遍。阳性血清及阴

性血清 分 别 用 稀 释 液 ( 1% 脱脂乳， PBS 配制) 从

1∶ 50 进行倍比稀释( 1∶ 50 ～ 1∶ 400) ， 100 μL /孔， 纵

向加入封闭后的抗原包被板中， 其余试验步骤均按

ELISA 方法进行， 试验结果标准副鸡禽杆菌阳性血

清值 OD450 nm值为 1. 0 左右， 阴性 OD450 nm值设为 0. 1

左右的范围选择 P /N 值最大为最佳稀释条件。

1. 3. 3. 2 最佳血清抗体孵育时间筛选 将血清用

稀释液稀释至相应浓度后加入抗原包被板， 100 μL /

孔， 分别 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h、2 h， 其余试验步骤均

按 ELISA 方法进行， 试验结果选择 P /N 值最大为最

佳孵育时间。

1. 3. 3. 3 酶标二抗最佳工作浓度及时间确定 完

成血清孵育并清洗后， 以稀释液分别稀释 HＲP 标记

兔抗鸡 IgG 抗体至 1 ∶ 5 000、1 ∶ 10 000、1 ∶ 20 000，

100 μL /孔， 分别 37 ℃ 孵育 0. 5 h、1 h， 其余试验步

骤均按 ELISA 方法进行， 试验结果选择 P /N 值最大

为最佳条件。

1. 3. 3. 4 显色时间确定 酶标二抗孵育结束并清

洗后， 加入 TMB 显色液， 100 μL /孔， 放置于 37 ℃ 孵

育 5、10、15、20 min 后加入 2 mol /L H2 SO4 终止读

数， 50 μL /孔。选择 P /N 值最大时最佳显色时间。

1. 3. 4 临界值的确定 在优化间接 ELISA 的最佳

条件后， 使用该方法对 30 份阴性血清进行检测， 根

据检测样品的 OD450 nm 值平均值和标准差设定该间

接 ELISA 方法的判定值: !X + 3 s; 待检样品 的

OD

450 nm值若大于判定值， 则该样品为阳性， 反之， 则

判为阴性。

1. 3. 5 交叉反应性试验 采用标记为 Hp8( A 型) 、

0221( A 型) 、0083( A 型) 、0222( B 型) 、BJ( B 型) 、

668( C 型) 、Modesto( C 型) 等不同血清型副鸡禽杆

菌分别单独感染的鸡血清作为待测阳性血清， 未经

免疫的 SPF 鸡血清为阴性血清， 各个血清样本做 3

个平行重复测试， 用于评价本方法的交叉反应性。

1. 3. 6 特异性检验 应用已建立的间接 ELISA 方

法， 对常见的大肠杆菌 O1、O2、O78 株， 流感( AI)

H9 亚型、新城疫 ( ND) LaSota 株 ( NDla) 和 F48 株

( NDf48) 、减蛋综合征( EDS'76) 、鸡毒支原体 MG-S6

等禽病病原的阳性血清进行检测， 并以标准副鸡禽

杆菌阳性血清为阳性对照， 测定 OD450 nm 值， 各个血

清样本做 3 个平行重复测试， 确定该方法的特异性。

1. 3. 7 ELISA 方法检测田间血清样品 本试验建

立的 ELISA 方法， 对所收集的临床免疫鸡血清， 进

行测定。各个血清样本做 3 个平行重复， 计算 OD

值， 并依照本试验所设标准判定检测结果。

1. 3. 8 ELISA 方法与 HI 试验 实验室收集的 120

份临床样品用 HI 试验进行对比试验， 分别用 3 个血

清型的 HA 抗原进行检测， 方法如下［7］ : 用血清稀释

液将吸附后的血清作 2 倍系列稀释， 第 1 孔为 1∶ 5，

第 2 孔为 1∶ 10， 依此类推， 共作 8 个稀释度( 1∶ 5，

1∶ 10， 1∶ 20， …， 1∶ 640) ， 每孔含有 50 μL 稀释血清。

在各管中加入 4 个 HA 单位的 HA 抗原 50 μL， 充分

混匀后在室温作用 20 min， 然后每管加入 1% 鸡红细

胞 50 μL， 充分混匀后在室温静置 60 min， 判定结

果， 以全抑制 HA 的血清最高稀释度为血清的 HI

效价。若试验血清的 HI 效价≥5， 即判为阳性。

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