光谱仪和分光光度计

仪器概况

       光谱仪（spectrometer）和分光光度计（Spectrophotometer）,是将成分复杂的光分解为光谱线的科学仪器。

       当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱，因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光 被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。因此：

入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光。

如果我们用蒸馅水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射光的损失，则 出现：

入射光=吸收光十透过光。

        不同的光源都有其发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。不同物质都有特定的吸收光谱，根据溶液的吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质成分。

        钙灯发射光谱：鸨灯光源所发出380〜780nm波长的光谱光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、 蓝、靛、紫组成的连续色谱，该色谱可作为可见光分光光度计的光源。

        氢灯（或笊灯）发射光谱：氢灯（或気灯）能发出185-400nm波长的光谱，可作为紫外光光度计的光源。

常用的波长范围包括：

（1）     200〜380nm的紫外光区；

（2）     380~780nm的可见光区；

（3）     2.5〜25卩m （按波数计为4000/®米〜400/厘米）的红外光区。

       用于测量200〜380nm的紫外光区物质吸光度的仪器为紫外分光光度计；

       用于测量380〜780nm的可见光区物质吸光度的仪器为可见光分光光度计（或比色计）：

       用于测量2.5〜25〃 m （按波数计为4000/厘米〜400/厘米）的红外光区物质吸光度的仪器为红外分光光度计 或原子吸收分光光度计。

工作原理

       光谱仪和分光光度计釆用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源， 光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品 的浓度成正比。

       单色光辐射穿过被测物质溶液吋，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比， 其关系如下式：

A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc

式中：A为吸光度：Io为入射的单色光强度；1为透射的单色光强度：T为物质的透射率；k为摩尔吸收系数; L为被分析物质的光程，即比色皿的边长；c为物质的浓度；

仪器用途

1.    核酸的定量

       核酸定量是紫外光谱仪和紫外分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核昔酸，单链、 双链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。

        除了核酸浓度，光谱仪和分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值， 用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nmo

       纯净的样品，比值大于1.8 （DNA）或者2.0 （RNA）。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类 物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比 值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。

2.    蛋白质的直接定量（UV法）

       这种方法是在280nm波长直接测试蛋白，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法, 将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存 在一些杂质，一般要消除320nm的“背景”信息。

3.    比色法蚩白质定量

       蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸） 与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反映的氨基酸数目直接相关，从而 反映蛋白质浓度。比色方法一般有BCA、Bradford、Lowry等儿种方法。

4.    细菌细胞密度（OD 600）

       实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要 釆用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养 液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。

5.    海洋学研究中痕量物质浓度

       WPI公司设计长光程液态样本流通池（LWCC）具有50、100、250和500不同的光程可以选择。因此，不同 光程长度的LWCC配合适的光源和检测器，常用于海洋学应用中营养物分析的流体注射分析系统（如硝酸盐、 亚硝酸盐、磷酸盐和铁离子检测等）。海水和淡水中CDOM （有色溶解有机物含量）的检测，因为海水中CDOM的 含量极低（0.007m-l）。

6.    大气环境中超低含量物质浓度

      大气中的SO2、硝酸盐、亚硝酸盐、羟基、棕碳、黑碳、水溶性铁、气溶胶等含量很低，使用普通的分光光 度计很难检测出来。将大气中釆集的样本液态化，再配合不同光程的LWCC进行检测，可以将这些含量极低的 物质加以检出。