YKLCaco-2 Caco-2人结直肠腺癌细胞

Caco-2人结直肠腺癌细胞Caco-2人结直肠腺癌细胞

密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞，在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min，弃上清，用90%培养液+10%DMSO的混合液重悬细胞，并调整细胞密度为4-6×106/ml，将细胞悬液分装到冻存管中(1-1.5ml/管)。

含量：>1x10⁶ 个/mL，  规格：T75瓶或者1mL冻存管包装

培养基：MEM培养基(GIBCO,货号41500034，添加NaHCO3 1.5g/L，Sodium Pyruvate 0.11g/L)，80%；优质胎牛血清，20%。 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度。

生长特性：贴壁生长

污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

运输和保存：可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式：（1）干冰运输，收到后立即转入液氮冻存或直接复苏；（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

传代操作步骤：

一、贴壁细胞传代

1.提前将培养基、PBS放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精擦拭后再放入超净台内。

2.吸除或倒掉细胞瓶内旧培养液，加少量PBS润洗细胞。

3.加入适量YM，使YM的量能盖住细胞，37℃孵育，每隔2~3min显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去YM，加入新鲜培养基，晃动细胞瓶，终止YM作用。

4.用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。控制吹打的力度，避免产生大量的气泡。

5.将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置37℃温箱培养，隔天观察贴壁生长情况。

二、悬浮细胞传代

1.将细胞悬液转移到无菌离心管内，1000rpm离心5min。

2.弃去上清，加入新鲜的培养基，用吸管小心吹散沉淀，制成细胞悬液。

3.将细胞悬液分别接种到另外的2~3个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置37℃温箱培养。

培养的过程中，经常见到黑色的颗粒或小黑点，这种情况是怎么引起的呢？该怎么避免呢？原因：

黑点，大概有细胞本身带的，环境有的，还有人身上带进细胞间的,还有就是血清和培养基

1、如果小黑点有增殖趋势，那么就有可能是污染了，需要处理；

2、如果小黑点没有增殖趋势，且不影响细胞生长，也不影响实验的话，则可能

 a、是“黑胶虫”，黑胶虫究竟是一种生物还是非生物，本身就存在争议。有人认为是从血清中来的一种原虫，也有人认为是细菌，或是真菌，也有人认为是血清中的蛋白的结晶。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候， 细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。以前（这个至少是10年以前），很多实验室在养细胞时用国产血清，那时的血清可能质量不过关，有所谓的“黑胶虫”，但是也没有明确的鉴定。但是现在的血清，即使国产的，产品里这种现象就少见了。

 b、是细胞碎片，或血清里德沉淀析出，在做布朗运动。

 c、是核糖体，也可能是杂质ZYC3429        HN    形态：贴壁，悬浮均有；上皮细胞样    培养条件：MEM/F12 +10% FBS