石蜡/冰冻切片TUNEL凋亡

TUNEL凋亡显色法

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理是当细胞发生凋亡时，DNA内切酶被激活，核小体间的基因组DNA被切断，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)

加上带有生物素(Biotin) 标记的dUTP即Bitin-dUTP.,随后于辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的streptavidin结合， 在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到细胞凋亡。

实验意义

1. TUNEL法是一种分子生物学 与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。

2.可用于石蜡切片冰冻切片培养的细胞等进行细胞凋亡检测，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3.操作简便快捷，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

实验步骤

1.石蜡切片TUNEL显色法:

①石蜡切片常规脱蜡至水，脱蜡剂二甲苯，至水剂乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液37°C反应15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室温固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封闭液(3%H202)室温封闭10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37°C反应1 h,用SSC室温15 min终止反应后,PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H202封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37*C反应30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次;

10.选择是否用DAPI复染细胞核;

脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

2.冰冻切片TUNEL显色法:

①新鲜组织经处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5~6 um;

②防脱玻片，贴片，室温阴干约12 h;

③4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室温固定10 min, PBS漂洗3x5 min;

④浸入封闭液(3%H202)室温封闭10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入邇透液(0.1% Triton X-100溶于PBS中)，室温通透30 S-2 min;

⑥加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37°C反应1 h,用SSC室温15 min终止反应后，PBS漂洗3x5 min; .

⑦浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，379C反应30-60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次:

@选择是否用DAPI复染细胞核;

脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

实验完成周期及交付标准

1.实验周期: 1-2周

2.交付标准:蜡块、切片、染色图片.实验报告(实验步骤、试剂、耗材等)

需确认的信息

1.样本的种属.

2.样本的类型(固定的组织or蜡块or切片)

3.是否提供试剂盒

4.拍照要求

实验代做服务：