BC4575-100T/48S α-淀*酶活性检测试剂盒 微量法

α-淀*酶（α-AL）活性检测试剂盒（碘-淀粉比色法）说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4575

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入6.25 mL试剂三，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂2-8℃保存8周；

2、 标准品：10 mg淀粉标准品。临用前加10 mL试剂三，置沸水浴中振荡溶解，配成1 mg/mL淀粉标准液，2-8℃保存四周。

产品说明：

淀*酶负责水解淀粉，包括α-淀*酶和β-淀*酶。α-淀*酶(EC 3.2.1.1)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。

α-淀*酶催化淀粉分子中的α-1,4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖以及糊精等，碘可以与未被水解的淀粉结合，生成在570nm下有特征吸收峰的复合物，其深浅可计算出淀*酶的活力单位。α-AL耐热，但是β-淀*酶可在70℃钝化15min。因此粗酶液经过70℃钝化15min，就只有α-AL能够催化淀粉水解。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

酶标仪/可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约0.1g样本，加1mL蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，室温离心10min，吸取上清液即为淀*酶原液。

2、液体：直接检测。（若有浑浊则离心后进行测定）

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到570nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 将淀粉标准液用蒸馏水稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。

实验中每个标准管需100µL标准溶液。

3、 按操作表依次加入各试剂：

三、α-淀*酶活性计算

1、标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。

2、α-淀*酶活性计算

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活力单位。

α-淀*酶活性 (U/g 质量)=x×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=0.1×x÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

α-淀*酶活性 (U/mg prot)= x×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.1×x÷Cpr

（3）按照液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1mg淀粉定义为1个酶活性单位。

α-淀*酶活性 (U/mL)= x×V样÷V样÷T=0.1×x

V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：样本总体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10min。

注意事项：

吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8 时，可以对样本进行适当稀释后测定。

实验实例：

1. 取约0.1g藜叶片，加1mL蒸馏水匀浆，匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，室温离心10min，吸取上清液，之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定=A空白-（A测定-A对照）=1.065-（0.849-0.220）=0.436，带入标准曲线y=2.628x-0.0051，计算x=0.168，按样本质量计算酶活得：

α-淀*酶活性 (U/g 质量)=0.1×x÷W=0.168 U/g 质量。

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