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Flag-Agarose 免疫沉淀试剂盒

货号：PFA025

存储条件：-20°C保存，Flag-Agarose beads经常使用可在4℃保存，-80或-20℃长期保存，避免反复冻融。

试剂盒组分：

产品简介：

   LABLEAD的免疫沉淀beads是基于基因工程改造的纳米抗体开发的；纳米抗体由传统抗体的重链可变区（VHH）组成，具有分子量小、亲和力高、特异性强，且耐酸碱高温环境等特点；基于纳米抗体的优点，LABLEAD的免疫沉淀beads避免了免疫沉淀结果出现轻重链污染的现象，并且节省实验时间。

实验步骤：

提示：尽量在4℃进行操作，洗脱蛋白方法一除外。

1.植物组织裂解处理：

取适量植物组织样本（叶片等）放置于冷冻液氮中，之后将冷冻后得植物组织样本放于研钵进行研磨，尽可能充分研磨破坏其细胞壁。加入500-1000ul 裂解液A或裂解液B（需加入PMSF溶液）进行裂解，为了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉按照600-800g离心力充分震荡 30min，裂解完成后 12000 rpm，离心 30min，吸取上清置于新的离心管中，弃去沉淀。（进行第3步）

2. 动物细胞

2.1 收集细胞：

根据实验要求收集适量的细胞，通常每个免疫沉淀反应大约使用 10⁶-10⁷ 个细胞。

2.2 裂解细胞：

根据实验要求选择使用溶液A或溶液B裂解细胞。在溶液A或溶液B中加入蛋白酶抑制剂，用500μl预冷的溶液A或溶液B重悬细胞；置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次；细胞裂解物4℃，20,000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。

3. 平衡珠子：

振荡充分混匀珠子， 吸取20μl Flag-Nanoab-Agarose beads到500μl预冷的溶液A或溶液B中，4℃，2,500g离心2分钟，丢弃上清液。

4. 结合蛋白：

将平衡好的beads加入到细胞裂解产物中，于4℃旋转混合结合30min-1h。

5. 清洗珠子：

根据实验要求选择使用溶液C或溶液D清洗beads。4℃，2,500g 离心2分钟，丢弃上清液。用500μl预冷的溶液C或溶液D重悬beads，4℃，2,500g条件下离心2分钟，丢弃上清液并重复洗涤3次。

6. 洗脱蛋白

方法一：

加入20μl 2×SDS-sample buffer重悬beads。95℃，加热10min充分变性，2,500g离心2分钟收集上清，收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。

方法二：

加入溶液E洗脱结合的蛋白，孵育时间30秒，期间不断混匀，2,500g离心2分钟收集上清，为了中和酸性的甘氨酸，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。

注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。收集的产物可进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。

注意事项：

1、关于裂解液与裂解液的选择：

裂解液A为温和裂解液，裂解液B为强裂解液，请根据自己实验样本选择相应的裂解液，如：若为胞质蛋白可选裂解液A或者A与B混合使用，若为核蛋白则可选择裂解液B。

漂洗液C和漂洗液D的选择：（裂解液D为高盐溶液，可能会破坏蛋白间较弱的相互作用），若两个蛋白相互作用强，同时还想减少非特异性结合，可选D；若两个蛋白相互作用弱的优先C。

2、尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

3、本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。