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中国科学家开发新型测序技术 揭示基因编辑工具Cas13的脱靶结合特征
2026年03月12日 16:42:13
来源：化工仪器网 作者：宋池 点击量：4742
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心团队近日开发出一种新型测序技术uSpyCLIP，可高灵敏度检测RNA结合位点。研究团队运用该技术揭示了Cas13核酸酶的脱靶结合特征，发现其存在引导RNA依赖性和非依赖性两类脱靶行为，为未来RNA编辑技术的应用优化提供了重要指导。
近日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心团队成功开发了一种名为uSpyCLIP的新型深度测序方法，该方法能够高灵敏度、高信噪比地检测RNA结合蛋白在RNA上的结合位点。研究团队运用这一技术，揭示了两种目前应用最为广泛的Cas13核酸酶——Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13b和Ruminococcus flavefaciens XPD3002 (Rfx)Cas13d的引导RNA依赖性以及非依赖性脱靶结合位点的特征，为未来RNA编辑、检测和治疗应用中Cas13和引导RNA的优化设计提供了指导。
该技术通过最小化RNA结合蛋白的融合标签设计，显著降低了对目标蛋白活性的干扰，在识别RNA结合位点时具有高灵敏性和高特异性。与传统方法相比，该技术在相同测序深度下能够检测到更多的结合位点，并且仅需1000个细胞即可完成RNA结合蛋白位点图谱的测定。此外，uSpyCLIP技术依托磁珠进行操作，便于实现自动化流程，可有效减少人工投入，整个检测流程仅需两天时间。
研究团队运用uSpyCLIP技术，绘制了dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA复合物在转录组中的结合位点分布图谱。结果显示，dCas13的结合行为比先前预想的更为广泛。研究同时对两种dCas13-gRNA复合物的脱靶结合行为进行表征和验证，证实dCas13蛋白的引导RNA非依赖性脱靶位点具有独特的RNA识别位点结构和序列特征。对引导RNA依赖性脱靶位点的分析显示，引导RNA的DR远端区和中部区域在决定结合特异性中具有关键作用。研究还发现，部分脱靶事件导致非靶标基因的mRNA和/或蛋白质水平发生变化，这表明基于dCas13或dCas13-效应子融合蛋白的应用，如转录后调控、RNA成像和RNA编辑，可能因脱靶结合而产生复杂的毒副作用。
这一研究为检测Cas13的脱靶结合位点提供了新的技术手段与研究策略，并深化了关于Cas13系统的认知。随着CRISPR–Cas13系统在临床和体内治疗应用中的推进，确保其靶向特异性变得日益重要。该研究通过对dPspCas13b和dRfxCas13d两种最广泛使用的Cas13效应器的全面分析，为特异性引导RNA的合理设计以及Cas13蛋白的工程改良提供了重要的理论支撑，对未来优化Cas13和引导RNA设计
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