反转录酶M-MLV使用说明（Promega）

1、产品简介
莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV RT）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，能使mRNA（>5kb）转录为cDNA。M-MLV RT的RNase H活性相对于禽成髓细胞瘤病毒反转录酶较弱，更适合用来反转录较长的mRNA。M-MLV RT应用于以RNA为模板合成cDNA的*条链。
注意：M-MLV RT的延伸性要低于AMV 反转录酶，因此要得到和用AMV 反转录酶一样产量的cDNA需加入更多单位的M-MLV反转录酶。

2、使用方法
1）使用方法简介以用2?g总RNA为例。在无RNase离心管中，加入0.5?g引物至含总RNA的样品中，总体积不大于15?l。70℃，5分钟打开模板链形成的二级结构。立即放于冰上降温防止二级结构恢复，随后短暂离心使液体集中在离心管底。
2）加入以下成分到已退火后的引物-模板混合物中。
注意：不要改变引物的加入比率。

M-MLV 5×Reaction Buffer                       5?l
dATP，10mM                                 1.25?l
dCTP，10mM                                 1.25?l
dGTP，10mM                                 1.25?l
dTTP，10mM                                 1.25?l
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor         25 units
M-MLV RT                                    200 units
无核酸水至zui后体积                          25l

3）轻轻混匀离心管，如果使用随机引物在37℃孵育60分钟，其他引物则42℃孵育。延伸温度在37～42℃之间*。
4）M-MLV RT 用于合成cDNA的*链。往后的合成则需要根据需要自行设计引物再次合成。
3、Buffer组成

M-MLV RT 5×Reaction Buffer
250mM     Tris-HCl（PH 8.3 室温下）
375mM     KCl
15mM     MgCl2
50mM     DTT

4、来源
大肠杆菌表达纯化

5、保存条件
-20℃保存。避免经常冻融

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