我能够想到四个重要因素影响背景是亮还是暗(我的经验来自生物学的组织/细胞免疫荧光染色实验):
光圈。光圈开得大,顾名思义所有光信号包括背景信号都会增强。
曝光时间。光信号再强,你只选取其中很少一部分来成像,也能够控制图像中的信号强度。
样品/玻片本身的自发荧光。
样品的非特异性染色。
总体是一个所有检测手段中共通的问题,即信噪比,信号与噪声比率。
1,2对信噪比影响不大,在背景过强时很难通过调整1,2来解决问题。如果背景不存在过强问题,则通过1确保有用信号足够强,通过2减低曝光时间至背景充分黑暗即可。
3,4才是控制信噪比的关键因素。自发荧光无法*避免,只能通过选取自发荧光较低的材料来控制,另外固定及染色过程中的一些试剂有可能影响样本的自发荧光。非特异性染色是更为常见的造成背景问题的原因,通过优化封闭条件,抗体/试剂用量,染色时长与温度等条件来调整。
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