血病融合基因 （BCR-ABL）核酸检测试剂盒使用说明书（PCR-荧光探针法）

【名称】

通用名：白血病融合基因（BCR-ABL）核酸扩增检测试剂盒

英文名：BCR-ABL Fusion Gene in Leukemia Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction （PCR）Diagnostic kit

汉语拼音：bai xue bing rong he ji yin （BCR-ABL））he suan jian ce shi ji he

【目的】本试剂盒适用于检测白血病患者外周血及骨髓等样本中BCR-ABL 融合基因的表达，以有利于评价患者化疗效果

及对微小残留病变复发的监测。其检测结果仅供临床参考。

【原理】本试剂盒选取一对BCR-ABL 融合基因特异性引物和一条特异性荧光杂交探针，应用Trizol 提取RNA，经逆转录

酶作用将RNA 转录成cDNA，后者在耐热DNA 聚合酶（Taq 酶）作用下，配以FQ-Buffer（内含Mg2+、Tris-HCl 等）、四种

核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对BCR-ABL 融合基因进行扩增，从而达到快速准确实时

定量检测之目的。

【组成】

备注： 10×RCLB、RNA 提取液A （500μl Trizol reagents）等另行配备。

【标本采集、保存和运输】

1. 适用标本类型：新鲜血样（EDTA2-Na 抗凝）或骨髓等标本。

2. 标本采集：

新鲜血液或骨髓：—用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血3-5 毫升，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠

抗凝剂的5ml 玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10 次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。

3. 保存和运输：标本应立即用于测试，也可保存于-80℃或液氮待测，标本运送时应采用 0℃。

【适用仪器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM 7300、LightCycler

等毛细管的仪器，MJ Opticon 系列或取得资格认证的定量PCR 仪。

【贮藏、规格及有效期】40 份/盒。-20℃避光保存，避免反复冻融。有效期12 个月。

【使用方法】

1．RNA提取

1.1 淋巴细胞分离（用户亦可用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞）：将抗凝血摇匀，取500μl 转至一洁净的1.5ml 离心管

中，编号标记。加入 1ml 1×RCLB-红细胞裂解液（RCLB,试剂盒配备 10×RCLB，使用前请用双蒸馏水按 1：9 比

例配制成 1×RCLB），剧烈震荡 30s，3000g 离心 5min，弃上清。重复裂解两至三次至无明显红色沉淀。加入 1ml

生理盐水，剧烈震荡 15s，13,000g 离心 1min，弃上清。沉淀加入 500μl RNA 提取液A （Trizol reagents），反复吹打，

室温放置5min。

1.2. 加入100μl 氯仿，用力震荡15s，室温静置2min，4℃ 13,000rpm 离心5min。

1.3. 小心将上层水相转移到干净离心管中，加 300μl 无水乙醇，然后加 10μl RNA 提取液B（使用前请室温溶解并充分

混匀），充分混匀，13,000rpm 离心1min。

1.4. 弃上清，加入500 μl 75%的DEPC 乙醇，充分混匀，13,000rpm 离心1min，小心吸去大部分乙醇。

1.5. 将提取管敞口在室温空气中干燥5min 待乙醇挥发干净，用20μl DEPC H2O 溶解沉淀。

阴性质控品：取100μl 阴性质控品加入 500 μl RNA 提取液A（Trizol reagents）充分震荡，室温放置 5min。后按 1.2~1.5 操

作。

BCR-ABL 阳性质控品：直接取 4μl 进行PCR 扩增。或按照 PCR 扩增介绍方法进行定量分析。

2. 逆转录 根据标本数量取 DEPC 水处理的 200μl PCR 反应管，取出BCR-ABL–RTMIX、逆转录酶系，室温融化并振荡

混匀后，10,000rpm离心 10s。向反应管中加 1μl逆转录酶系，7μlBCR-ABL-RT-MIX，充分混匀后短暂离心，42℃30 分

钟，后98℃ 5min 灭活逆转录酶。即得到cDNA。

3．PCR扩增

从试剂盒中取出BCR-ABL PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心 10s。

设所需要的PCR 反应管管数为N（N=样本数+1 管阴性对照+4 管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管

中分别加入 26μl，向每管中加入处理后样品（所获得的cDNA样品）或BCR-ABL–阳性质控品（使用前用阴性质控品梯度

稀释 10 倍、100 倍、1000 倍，记为 1×10P6P Copies/ml，1×10P5P Copies/ml，1×10P4P Copies/ml） 和阴性质控品 4μl，10,000rpm

瞬时离心30 秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性定量标准品以及未知标本，

并设置反应体积（30μl）、样品名称、标记荧光基团种类（报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA）和循环条件：

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 （需要剪掉反应盖），ABI PRISM7300/7500（使用8 联管），

MJ Opticon（使用8 联管）等使用薄壁管的仪器，循环条件：94℃→2 分钟，后93℃ 30 秒→55℃ 45 秒， 40 个循环。

LightCycler 等使用毛细管的仪器，循环条件：94℃→2 分钟，后93℃ 5 秒→56℃ 45 秒，共40 个循环。

3．结果分析判定

反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline 的start 值（3~8），stop 值（13~18）以及Threshold

值，使Std curve 窗口下的标准曲线达到*（correlation 数值介于-0.97~-1 之间，correlation 数值等同于∣r∣值），zui后

到Reporter 窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty-Copies/ml）。

【质控标准】

阴性质控品：全部阴性。没有荧光值增长。

BCR-ABL 阳性质控品：阳性质控品的 Ct 值均应小于 35.0。

∣r∣≥0.97（correlation 数值介于-0.97~-1 之间，correlation 数值等同于∣r∣值）。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

【结果判定】

测定结果的计算：

如果Ct值﹤38，则实验样品的BCR-ABL 含量（基因拷贝数/ml）= Qty-Copies/ml。

如果38﹤Ct 值﹤40,为灰区建议重新检测，重新检测若38﹤Ct 值﹤40 判为阳性，否则为阴性。

如果Ct值=40，则BCR-ABL含量（基因拷贝数/ml）﹤1×10P

2

PCopies/ml （低于检测下限）。

【注意事项】

使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。

试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。

试剂盒须避光保存，以免荧光物质衰减。所有使用的离心管、Tip 头应DEPC 水处理并高压灭菌，而且必须不含RNase。

样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。