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大鼠血清淀粉样蛋白A(SAA)ELISA试剂盒说明书

来源:厦门慧嘉生物科技有限公司   2013年07月23日 09:43  

 大鼠血清淀粉样蛋白A(SAA)酶联免疫分析试剂盒

使用说明书

                      厦门慧嘉生物科技有限公司

本试剂盒仅供体外研究使用!

预期应用

ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中SAA含量。

实验原理

用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗SAA抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗SAA抗体、HRP标记的亲和素,经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的SAA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。 

试剂盒组成及试剂配制 

1. 酶联板:一块(96孔) 

2. 标准品(冻干品):2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为10 ng/ml,做系列倍比稀释注:不要直接在板中进行倍比稀释后,分别稀释成10 ng/ml5 ng/ml2.5 ng/ml1.25 ng/ml0.625 ng/ml0.312 ng/ml0.156 ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml,临用前15分钟内配制。如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液1×20ml

4. 检测稀释液A1×10ml

5. 检测稀释液B1×10ml

6. 检测溶液A1×120μl1:100)临用前以检测稀释液1:100稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl检测溶液A990μl检测稀释液A的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液1:100稀释。稀释方法同检测溶液A

8. 底物溶液1×10ml/瓶。 

9. 浓洗涤液1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 

10. 终止液1×10ml/瓶(2N H2SO4)。 

11. 覆膜5

12. 使用说明书:1

自备物品 

1.   酶标仪(建议参考仪器使用说明提前预热) 

2.   微量加液器及吸头,EP

3.   蒸馏水或去离子水,全新滤纸 

标本的采集及保存 

1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

3. 细胞培养物上清或其它生物标本:请1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

4. 样本处理:血清或血浆标本推荐稀释100100倍以上。

注:以上标本置4℃保存应小于1周,-20℃或-80℃均应密封保存-20℃不应超过1个月,-80℃不应超过2个月;标本溶血会影响zui后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

实验开始前,各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量,如样品浓度过高时,应对样品进行稀释,以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围,计算时再乘以相应的稀释倍数。

1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。

2. 弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100μl(在使用前一小时内配制),酶标板加上覆膜, 37℃反应60分钟。

3. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。 

4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100μl,酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5. 温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

6. 依序每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37避光显色30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。

7. 依序每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后立即进行检测。

1.  试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存试剂。  实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。

2.   加样:加样或加试剂时,请注意在吸取标本 / 标准品,酶结合物或底物时,*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大,将会导致不同的 “预孵育时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)控制在10分钟内,如标本数量多,推荐使用多道移液器加样。

3.   孵育:为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜,以避免液体蒸发;洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态;同时应严格遵守给定的孵育时间和温度。

4.   洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响zui后的酶标仪读数。

5.  试剂配制:Detection ADetection B在使用前请手甩几下或少时离心处理,以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配置使用,并使用相应的稀释液配制,不能混淆。请配置标准品及工作液,尽量不要微量配置(如吸取检测溶液A时,一次不要小于10μl),以避免由于不准确稀释而造成的浓度误差;请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或检测溶液B工作液。

6.  反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,每隔10分钟),如颜色较深,请提前加入终止液终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

7.  底物:底物请避光保存,在储存和温育时避免强光直接照射。

    建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。

    如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请zui后乘以稀释倍数。

洗板方法

1.  手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟,根据需要,重复此过程数次。

2.  自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的大鼠SAA,且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为纵坐标(对数坐标),OD值为横坐标(对数坐标),在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析,如curve expert 1.3,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 

检测范围:78ng/ml-5000ng/ml

灵敏度:19.5 ng/ml

说明 

1. 只有全部使用试剂才能保证检测效果,因为所有试剂都是有关联的,不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守试剂的试验说明才会得到*的检测结果。

2. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染,试剂避免受到微生物的污染,因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

3. 试剂盒保存:短期(1周以内)以标签上的标示为准,长期保存请将试剂全部保存于-20℃。

4. 浓洗涤液会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶。 

5. 刚开启的酶联板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。 

6. 所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。

7. 有效期:6个月。

8. 本操作说明适用于48T试剂盒,但48T试剂盒所有试剂减半。

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