中华人民共和国国家标准

GB 5009.296-2023

食品安全国家标准 食品中维生素D的测定

第二法 在线柱切换-反相液相色谱法

9原理

  试样经氢氧化钾乙醇溶液皂化，液液萃取或固相萃取净化、浓缩后，一维液相色谱通过C8柱将维生素D与其他杂质分离后，由柱切换阀转入二维液相色谱中，通过C18柱分离维生素D2 和维生素D3，紫外检测器检测，内标法（或外标法）定量。当试样中不含维生素D2时，可用维生素D2作内标测定维生素D3；当试样中不含维生素D3时，可用维生素D3作内标测定维生素D2。否则，用外标法测定。

10试剂和材料

  除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

10.1 试剂

10.1.1无水乙醇（C2H6O）：色谱纯。

10.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。

10.1.3 2，6-二叔丁基对甲酚（C15H24O）：简称BHT。

10.1.4 a-淀粉酶（CAS号：9000-90-2，中温淀粉酶，来源于芽孢杆菌属）：酶活力≥1.5 U/mg。

10.1.5氢氧化钾 （KOH）。

10.1.6正己烷（C6H14）。

10.1.7乙酸乙 酯（C4H8O2）。

10.1.8乙腈（C2H3N）：色谱纯。

10.1.9甲醇（CH40）：色谱纯。

10.2试剂配制

10.2.1氢氧化钾溶液（50%，质量分数）：同3.2.1。

10.2.2 BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL）：同3.2.2。

10.2.3乙醇-水溶液（2 +3）：将乙醇和水按2：3的体积比混合均匀。

10.2.4乙酸乙酯-正己烷溶液（3+2）：将乙酸乙酯和正己烷按3： 2的体积比混合均匀。

10.2.5乙腈-甲醇溶液（3+1）：将乙腈和甲醇按3：1的体积比混合均匀，超声脱气。

10.2.6甲醇-水溶液（1+19）：将甲醇和水按19：1的体积比混合均匀，超声脱气。

10.2.7乙腈-水溶液（19+1）：将乙腈和水按19：1的体积比混合均匀，超声脱气。

10.3标准品

10.3.1维生素D2标准品：同3.3.1。

10.3.2维生素D3标准品：同3.3.2。

10.4 标准溶液配制

10.4.1维生素 D2标准储备溶液（1000 mg/L）：同3.4.1。

10.4.2维生素 D3标准储备溶液（1000 mg/L）：同3.4.2。

10.4.3维生素 D2标准溶液中间液（10.0 mg/L）：同3.4.3。

10.4.4维生素 D3标准溶液中间液（10.0 mg/L）：同3.4.4。

10.4.5维生素 D2标准使用溶液（1.00 mg/L）：吸取10.00 mL维生素D2标准溶液中间液（10.0 mg/L）于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。在-18℃是谁的下避光保存，保存期1个月。

10.4.6维生素 D3，标准使用溶液（1.00 mg/L）： 吸取10.00 mL维生素D3标准溶液中间液（10.0 mg/L）于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。在-18℃下避光保存，保存期1个月。

10.4.7标准系列工作溶液的配制

10.4.7.1当用维生素 D3作内标测定维生素D2时：分别吸取维生素D2标准使用溶液（1.00 mg/L）0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D3内标使用液（1.00mg/L）2.00mL，用初始流动相稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，维生素D3内标质量浓度为20μg/L。临用前配制。

10.4.7.2当用维生素 D2作内标测定维生素D3时：分别吸取维生素D3标准使用溶液（1.00 mg/L）0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL和10.00 mL于100 mL棕色容量瓶中，各加入维生素D2内标使用液（1.00 mg/L）2.00 mL，用初始流动相稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，维生素D2内标质量浓度为20μg/L。临用前配制。

10.4.7.3当用外标法同时测定维生素D2和维生素D3时：分别吸取维生素D2标准使用溶液

（1.00 mg/L）、维生素D3标准使用溶液（1.00 mg/L）各0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL和10.00mL于100mL棕色容量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，混匀。此标准系列工作溶液质量浓度分别为2.5μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L。临用前配制。

10.5 材料

10.5.1固相萃取柱：以聚苯乙烯共聚物（PS-DVB）为基材的填料，6 mL，200 mg，或相当者。

10.5.2微孔滤膜：有机系，孔径0.45 pm。

11仪器和设备

11.1在线柱切换液相色谱系统，带紫外检测器。

11.2 天平，感量为0.1 mg、0.001g、0.01 g。

11.13紫外分光光度计，带1cm石英比色皿。

11.4磁力搅拌器，带加热、控温功能。

11.5恒温振荡器。

11.6 多功能振荡器，带适用于50 mL离心管的适配器，转速>1 500 r/ min。

11.7离心机，使用适用于50mL离心管的适配器，转速≥8000r/min。

11.8 旋转蒸发仪。

11.9 氮吹浓缩仪。

11.10 超声波清洗器。

12分析步骤

12.1 样品前处理

  处理过程应避免紫外光照射。

12.1.1 试样制备

  将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后，储存于样品袋中，避光冷藏，尽快测定。

12.1.1.1婴幼儿配方食品 、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料

  固体试样：按5.1.1.1制备试样溶液，称取制备后的溶液5g（m3，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。按式（1）计算粉末样品质量（m）。

  液体试样：称取摇匀后的试样5 g（m，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。

12.1.1.2谷物及其制品、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  称取均质后的试样5 g~10 g（m，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中，加入约20 mL温水（40℃~45℃），置于磁力搅拌器中搅拌10min，混匀。婴幼儿谷类辅助食品参考5.1.1.1先制成浆液，再称取制备后的浆液20 g~50 g（ms，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。

12.1.1.3 油脂及其制品、肉及肉制品、水产及其制品、蛋及蛋制品

  称取均质后的试样0.5 g~2 g（m，精确至0.001 g）至50 mL带螺旋盖的离心管，加入3 mL~4.5 mL的温水（40℃~45℃），置于涡旋振荡器中振荡10 min，混匀。对于难均质的试样，可参考5.1.1.1先制成浆液，再称取制备后的溶液5 g（m3，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。

12.1.1.4水果 蔬菜、豆类、食用菌、坚果和籽类

  称取均质后的试样5g（m，精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中。干制品称取均质后的试样0.5 g~2 g（m，精确至0.001 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中，加入3 mL~4.5 mL的温水（40℃~45℃），置于涡旋振荡器中振荡10 min，混匀。

12.1.1.5含 蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  称取均质后的试样2 g~20 g（m，精确至0.01 g）至150 mL平底烧瓶中。

12.1.2 试样皂化

12.1.2.1婴幼儿配方食品 、特殊医学用途配方食品、乳及乳制品、冷冻饮品和饮料等试样

  按12.1.1.1、12.1.1.3、12.1.1.4中描述的样品前处理方法称取适量试样于50 mL离心管中，加入100 μL内标使用溶液（1.00 mg/L，如测定维生素D2，用维生素D3作内标；如测定维生素D2，用维生素D2作内标） ，加入0.4 g抗坏血酸，6 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），涡旋混匀30 s，再加入3 mL氢氧化钾溶液（50% ，质量分数） ，涡旋混匀后于恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温，加入5 mL乙醇-水溶液（2+ 3），混匀，待提取净化。

12.1.2.2谷物及其制品 、焙烤食品、婴幼儿谷类辅助食品及其他含淀粉试样

  在12.1.1.2中描述的150 mL平底烧瓶中，加入500 μL内标使用溶液（1.00 mg/L，如测定维生素D2 ，用维生素D3作内标；如测定维生素D3 ，用维生素D2作内标），加入1.0g a-淀粉酶，放入1颗磁力搅拌子，加上瓶塞，放入60℃磁力搅拌器中酶解30min，立即冷却至室温，向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），混匀。再加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数） ，边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h） ，皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇-水溶液（2+ 3）将皂化液转移至100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，准确移取20 mL皂化液于50 mL的离心管中，待提取净化。

12.1.2.3含蜂蜡等黏稠胶质试样和其他食品

  在12.1.1.5中描述的150 mL平底烧瓶中，加入500 μL内标使用溶液（1.00 mg/L，如测定维生素D2，用维生素D3作内标；如测定维生素D3，用维生素D2作内标） ，加入1.0 g抗坏血酸和30 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），放入1颗磁力搅拌子，将平底烧瓶置于磁力搅拌器中搅拌，混匀后加入约20 mL的温水（40℃~45℃），混匀，再加入10 mL~20 mL氢氧化钾溶液（50%，质量分数），边加边振摇，混匀后于磁力搅拌器或恒温振荡器中皂化，温度80℃±2℃，时间30 min（或温度25℃±5℃，时间16 h±2 h），皂化后立即用冷水冷却至室温。用乙醇水溶液（2 +3）将皂化液转移至100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，准确移取20mL皂化液于50mL的离心管中，待提取净化。

  注：如用外标法，皂化条件选择温度25℃±5℃，皂化时间16 h±2 h。

12.1.3试样提取净化

12.1.3.1液液萃取法

  于上述装有皂化液的离心管中加入5 mL水，混匀，加入20 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液（3+2），振荡提取10 min，8 000 r/min离心3 min，将上层溶液转移至另一50 mL的离心管中，于原离心管中再加入10 mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液（3+2），再次振荡提取10 min，高速离心机8000 r/min离心3 min，合并上层有机相于同一离心管中，加水至45 mL，振荡30 s，8 000 r/min离心3 min，将上层有机相转移至旋蒸瓶中，于40℃旋蒸至约1 mL，用乙酸乙酯-正己烷混合溶液（3+2）转移至10 mL试管中，置于氮吹仪中吹至近干，用约4 mL乙腈-甲醇溶液（3+1）分3次溶解并转移至5 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，过0.45pμm微孔滤膜，供液相色谱测定。

  注：可根据实验室条件选择浓缩方式，氮吹仪或冷冻浓缩仪均可用于浓缩。最终定容体积可根据样品情况增减。

12.1.3.2固相萃取法

  固相萃取法适用于婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、调制乳（粉）、豆浆（粉）。

  于上述皂化液中加入0mL~15mL去离子水（使用不同品牌的固相萃取柱，去离子水的加量不同，需经验证后确定），涡旋混匀，8000r/min离心5min。全部上清液转移至固相萃取柱中（临用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化平衡）上样，过柱速度控制在不超过60滴/min。用10 mL甲醇-水溶液（1+19）洗涤离心管，涡旋30s，8 000 r/min 离心5 min，将上清液一并转移到固相萃取柱上样，重复操作2次。上样完毕，负压抽干固相萃取柱，用8 mL乙腈-甲醇溶液（3+1）分3次洗脱，洗脱液加水定容至10mL，过0.45μm微孔滤膜，取滤液进样。

  注：如仪器灵敏度或进样体积受限，可将洗脱液氮吹至一定体积，再加水定容至适当体积，保持最终进样液中的溶剂体系为初始流动相体系。全自动在线固相萃取法可优化操作参数后使用。

12.2仪器参考条件

仪器参考条件如下：

a）一维色谱柱：C8柱，柱长150 mm，柱内径4.6 mm，粒径5μm，或相当者；

b）二维色谱柱：多环芳烃（PAH）C18柱，柱长150 mm，柱内径4.6 mm，粒径3μm，或相当者；

c）柱温：35℃；

d）一维流动相：A相，水；B相，乙睛-甲醇（3+1，体积比）；梯度洗脱：0 min~16 min， 80%~100% B；16 min~19 min，100% B；19.0 min~19.5 min，100%~80% B；总运行时间30 min；

e）二维流动相：A相，乙腈水溶液（19+1，体积比）；B相，甲醇；95% A等度洗脱，总运行时间30 min；

f）流动相流速：一维流速，1.0 mL/ min；二维流速，0.4 mL/ min；

g）波长：264 nm；

h）进样量：100 μL；

i）根据维生素D在一维色谱柱上的保留时间确定六通阀切换时间：0.00 min~10.95 min，阀状态1；10.95 min~11.45 min，阀状态2；11.45 min~ 30 min，回到阀状态1，在线柱切换流路图见附录C；

j）富集柱：C18柱，柱长 5 mm，柱内径4.6 mm，粒径4μm，或相当者。

12.3标准曲线的制作

  将标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中，以标准系列工作溶液中维生素D2（或维生素D3）的浓度为横坐标，以维生素D2（或维生素D3）的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。维生素D2和维生素D3标准溶液的一维色谱图参见图B.2，二维色谱图参见图B.3。

12.4试样溶液的测定

12.4.1定性分析

  将试样溶液注入液相色谱仪中，同样测试条件下，试样溶液中维生素D2、维生素D3的保留时间与标准工作溶液中相应的保留时间相比，偏差应在±2.5%以内。

12.4.2定量测定

  将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到维生素D2（或维生素D3）的峰面积，根据标准曲线得到待测液中维生素D2（或维生素D3）的浓度。待测试样溶液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围，可以适当减少取样量重新测定。

12.5空白试验

  不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。内标法需要做不加内标的样品试验，确认加入内标的可行性。

13分析结果的表述

试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，内标法按式（2）和式（3）计算，外标法按式（5）计算。

式中：

X——试样中维生素D2（或维生素D3）的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；

c——根据标准曲线得到的进样溶液中维生素D2（或维生素D3）的质量浓度，单位为微克每升；

V——进样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；

100——由每克换算为每百克的换算系数；

n——试样的取样量，单位为克（g）；

1 000——由μg/L换算为μg/mL的换算系数；

f——稀释因子。

  计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

  如试样中同时含有维生素D2和维生素D3 ，维生素D的测定结果以维生素D2和维生素D3的含量之和计算。

14 精密度

  在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

15其他

  当固体试样取样量为0.50 g，定容5.00 mL时，维生素D2、维生素D3的检出限为0.6 μg/100 g，定量限为2 μg/100 g。

  当液体试样取样量为5.00 g时，定容5.00 mL时，维生素D2、维生素D3的检出限为0.06 μg/100 g，定量限为0.2 μg/100 g。