食品卫生微生物检验中培养基的质量控制！

百欧博伟生物：当前食品的安全性问题日益受到重视 ，由于食品从原辅料、生产制造过程到消费的各个环节都可能受到各种微生物的影响，如果生产过程及工艺控制不当，处理不*则很容易造成微生物的残留和繁殖，影响产品的品质甚至危及人体的身体健康。近年来随着国家对食品安全重视程度的提高，食品饮料企业越来越注重微生物检验 ，以监测食品生产，及早发现微生物的污染，利于采取措施防止微生物危害，保障食品安全。虽然国家标准 G B／T 4 7 8 9.1 ～ 4 7 8 9.3 1 -2 0 0 3中对食品卫生的微生物学检验方法、检验用的培养基、检验步骤作了具体规定，但在实际工作中还存在着许多复杂因素，忽视这些因素很可能给检验结果带来偏差，甚至错误，从而无法正确评价产品的卫生状况 ，无法正确指导与监督产品生产。本文从培养基的水化、灭菌和使用、物理和生物学的质量控制，谈一些观点和看法。希望有利于微生物检验工作的同行们更好的开展工作。

一、培养基的制备及水化

1、培养基的配制

自制培养基必须准确根据处方，并作详细记录，因培养基处方中的成分大部分为生物制品，各厂家生产或同一厂家生产的不同批次的产品质量会有一定的差异性，因此应对配方中的各原料成分进行相应的质量控制，另外，必须记录所有用到的各种成分的全部特征( 如代码和批次) 。特别注意的是自制的培养基各成分应该分别添加，注意添加顺序，并且分装灭菌之前各成分应互溶或*均匀。

2、干粉培养基的使用

随着微生物检验行业的发展，有了一系列商业化的干燥培养基，其以便利、实用和高效得到微生物检验行业的广泛认可。专业的培养基生产厂家应有标准的生产工艺，对原材料及成品进行严格的控制，以保证质量合格、稳定，检测结果的准确和可重复性。

微生物检验用的各种药品、试剂和干粉培养基必须是专业厂家生产的产品，质量必须符合有关的质量标准，并且生产商应提供培养基的名称、产品编号、批号、各种成分和任何补充成分、培养基使用前的pH值、贮存资料及有效期等信息，以利于使用者对产品进行记录和比较。

3、培养基水化的容器

培养基水化时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；并防止部分或新玻璃瓶在加热过程中会释出碱性物质，使培养基的pH改变；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出。

4、培养基水化的用水

使用蒸馏水或与其同质的水，即不含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质。严重污染的去离子水即使经过滤除菌还是可能含有抑制一些微生物生长的物质；避免使用自来水，因其中含有氯等抗菌物质；培养基水化时逐渐加入适量的水 ，可先将 1／3水量置入容器中，震摇后 ，再加入剩余的2／3水量，并顺势将附着于容器壁的培养基粉冲下。

5、培养基的称量

称量时要用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；称量时注意不要吸入粉末，特别是选择性培养基；培养基易吸潮，吸潮后可导致培养基酸化，改变培养基的p H等。如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基；干粉培养基应严格按照生产商提供的有关说明准确配制。

二、培养基的溶解及灭菌

1、培养基的溶解

在培养基分装灭菌前，各成分应溶解均匀，水浴加热溶解，含有琼脂的粉末状培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；使用电炉等设备煮沸培养基时，应用小火加热，并边加热边搅拌，避免培养基焦化或爆沸溢出。烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质。如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。

2、培养基的灭菌

一般培养基采用湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌，通常是121℃ 15 m i n ，含糖或特殊培养基，按照生产厂家提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，配制培养基的用水、容器和干粉中均含有大量的微生物，溶解均匀后，要避免微生物生长繁殖而消耗养分， 改变培养基的酸碱度，产生有毒或未知物质。如果配制体积比较多，要注意溶解充分、均匀，分装时要注明培养基名称、配制时间等。高温可破坏培养基的营养成分，特别是氨基酸、 维生素和糖；高温还会使琼脂的凝胶强度下降。在高温情况下，某些营养成分还可能由于受热而相互发生反应，如磷酸盐与碳酸钙反应形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性磷酸盐的浓度大为降低，并易形成沉淀；还原糖与氨基酸、肽、蛋白质等发生化学反应，形成5一羟甲基糠醛和类黑精； 高温反应时可能形成有毒物质，影响微生物生长。湿热灭菌必须严格控制灭菌温度和时间。并且不可重复高温灭菌。

某些强选择性培养基不需要高压蒸汽灭菌，可以通过煮沸法进行消毒，部分试剂可以在未灭菌的情况下使用。应根据、国家标准或生产商提供的说明灭菌。

3、影响灭菌效果的因素

高压蒸汽灭菌锅在使用时，内置物品不能太多，不要堆积形成死角；单位体积内的内容物( 每瓶内的培养基) 不能太多， 一般固体 < 2 0 0 m l ， 液体 <1 L ，否则热传递效果欠佳 ；并且要排放干净冷空气，否则实际温度达不到设置温度； 要定期对压力表等进行检定，检定周期一般为半年；并定期对灭菌效果进行检验，可采用生物指示菌法、化学变色纸片等进行验证。

三、平板的制备

1、培养基的 p H

微生物必须在适宜的 p H范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的 p H为灭菌或消毒后的p H值，即培养基使用前的 p H，并应在 2 5 ℃温度下采用精密酸度计进行测量，固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。

在使用过程中，如果需要调整培养基的 p H，应用 1 mol/ L  NaOH或 1 mol/L  HC1 调整 pH，注意不可反复调 p H，否则会影响培养基的渗透压。

2、培养基的保温

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。采用水浴锅保温，水温一般调至 4 5℃ ～55℃，水位液面应略高于培养基液面，倾注平板时，取出培养基自然降温至4 0℃ - 45℃左右。建议以较低的温度进行平板倾注，可减少对样品中微生物的热损伤，并可减少平板表面的冷凝水，利于观察结果。

3、补充物质的添加

补充物质有可能为有毒物质，配制和添加时小心处理避免吸入粉末。采取适当的预防措施并根据生产商的说明书配制溶液。补充物质一般为热敏试剂。在培养基冷却至 4 7℃±2 ℃时加入补充物质，过冷的液体有可能导致琼脂凝固或形成片状物，补充物质在加入时，应为室温或 4 0 ℃ 左右；轻柔顺序加入补充物质，然后尽可能快的分装或倾注。

在某些情况下，抗生素溶液可以在合适的包装下冻存，但在解冻以后再次冻存，可能会降低活性，必要时用户应该通过实验验证。补充物质一般为活性物质，不要使用过期产品。

4、倾注培养基

平板中培养基的厚度至少应是 2mm( 如 90mm的平板，通常倾注 l5 ml培养基 ) ，平板放在冷而平的地方使琼脂凝固。

四、培养基的接种与培养

1、培养基的接种

平板在接种使用时，表面必须无 明显潮湿水珠，潮湿的平板容易造成菌落扩散 ，不易进行计数，或进行平板分离时 ，造成菌落不纯。倾注平板培养基温度较高会造成平板潮湿。可将平板放置在 2 5℃～ 5 0℃烘箱内，至培养基表面的水滴*消失，注意不要过度加热。

对于保存的培养基，需待温度回复至室温后才可使用，并且使用前应检查 ：有无污染菌落形成、培养基颜色是否发生改变、固态培养基表面有无干裂现象、有无脱水现象等，一旦出现异常， 该培养基应作废弃处理。

2、接种物的培养

琼脂平板不要堆积高于 6个， 留有一定的空间使空气流通，使平板的温度尽快而均匀地接近设置温度。在厌氧罐里应堆积超过 6个平板的高度。对于液体培养基要依据培养基的体积、容器类型而定。培养时，琼脂平板培养基有可能丧失一定的湿度。丧失1 5 ％ 的水含量时，在一些情况下将对微生物的生长不利。影响水分丢失的因素有培养基成分、平板中培养基的量、培养箱的类型、培养箱中平板的位置和数量、培养基温度等。必要时，可放入装水容器以维持箱内的湿度。

五、培养基的物理学及生物学质控

1、培养基的物理学控制

商品化的干燥培养基包装应易于达到密封条件，利于保存培养基的干燥性及光敏感成分的活性；制备的培养基平板应有相应的颜色，如血平板就为血红色，一般的培养基应澄清无浑浊、无沉淀；溶解温度、凝固温度应做相应的检测，对于倾注平板的培养基，凝固温度不应高于 4 0 ℃，以利于低温倾注平板 ，尽量减少对样品中微生物的热损伤。

2、培养基的生物学控制

培养基在灭菌后 ，应做无菌实验，以确保灭菌效果；使用培养基目标菌生长率测试，非目标菌的选择因子测试；菌落大小及相应生理生化特征检测等。对每批产品应用相应的标准菌株进行检定，并对实验的结果加以记录。

六、培养基的贮存

干燥培养基在使用时，应遵循先入先出的原则，贮存于阴凉干燥处，避免强光直射。如果培养基在称量使用过程中，吸潮，发生结块或颜色改变的培养基不可继续使用。

建议平板倾注后立即使用。保存时，尽可能贮存在不会改变其成分的条件下，即避光和／ 或在 4 ℃ ～1 2℃冰箱密闭保存，减少培养基中有效成分和水分的挥发，保证检出率。一般不超过 1 个星期或者遵循特定的标准或生产商的说明。在平板上标上制备日期和／或有效期和名称。

培养基的质量是微生物实验室检测工作的基础，事关检测工作的准确性、可靠性，在微生物实验室检测工作中举足轻重。如果在工作中忽视任何一个环节的质量问题， 都将导致检验结果科学性、客观性的偏离。因此，加强培养基的实验室质量控制 ，认真地做好培养基的质控工作，不断完善和提高培养基的质控水平，才能为微生物检测实验室提供高质量的培养基。

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