分秒必争，赛默飞Orbitrap质谱参与xin冠抗疫研究

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    赛默飞世尔，作为抗疫先锋之一，在背后助力科学家的研究，守护我们的健康 ，让世界更安全。

由SARS-CoV-2（2型严重急性呼吸综合征冠状病毒）引起的xin型冠状病毒肺炎（COVID-2019）具有高传染性，xin型冠状病毒肺炎在中国和的迅速传播引发了卫生紧急情况。ding尖的科学家针对xin冠病毒进行争分夺秒的研究，利用Orbitrap质谱技术参与分析病毒相关蛋白结构，病毒感染机制等内容，本文将讨论Orbitrap高分辨质谱在xin冠病毒感染致病等机制的亮点研究及技术进展。

1. 靶向蛋白定量方法监测xin冠病毒蛋白动态变化

Orbitrap Eclipse高灵敏度平行反应监测靶向定量xin冠病毒蛋白

2019年美国质谱年会，赛默飞重磅推出三合一系列的创新之作——Thermo Scientific^TM Orbitrap Eclipse^TM 质谱仪，旨在解决生物学研究中的分析难题，轻松应对蛋白质组学，生物制药与蛋白质高级结构分析研究中的各项挑战，推出不久即投入到xin冠病毒研究中。

近，荷兰鹿特丹伊拉斯马斯大学研究团队使用 Orbitrap Eclipse检测SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列，作为潜在的诊断工具。作者利用easy1200液相和Eclipse质谱使用靶向方法-平行反应监测（PRM）追踪病毒感染Vero细胞后，几种SARS-CoV-2蛋白的肽段变化。作者研究了SARS-CoV-2蛋白PRM实验的检测限，主要是核衣壳蛋白（NCAP），这是丰富的病毒蛋白，因此是比较好的候选测试分子。Orbitrap Eclipse 质谱的PRM结果显示对该蛋白灵敏度可达到amol级别，大约为0.9pg。粗略计算表明，这种灵敏度水平应足以检测理论上与约10000个SARS-CoV-2颗粒相对应的蛋白量。且其他SARS-CoV-2蛋白也是PRM靶向方法的良好候选蛋白^[1]。

图. Orbitrap Eclipse靶向PRM监测SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列

此外作者还在进行了整体蛋白质组学分析。在60-90分钟分析时间内，共鉴定出6500种相关蛋白质。这表明蛋白质组学可以用来研究病毒感染宿主细胞的蛋白质组，是未来新兴的研究工具。

2. 蛋白质组学研究xin冠病毒感染的调控机制研究

2.1 Orbitrap 高分辨质谱研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染机制

SARS-CoV-2病毒的基因组有29811个核苷酸，可编码28-29个蛋白质。其中一个蛋白质E 是一种包膜蛋白，是有助于形成病毒油泡的结构蛋白。一旦病毒进入细胞，它还有其他的功能。例如，附着在蛋白质上，有助于打开和关闭我们自己的基因。当E蛋白干扰时，模式可能会改变。VISTARA BIOSCIENCE研究人员近进行一项研究发现，蛋白质E与寄主细胞中的溴多胺蛋白结合。Bromodomain 4（BRD4）是BET亚家族蛋白，通过识别乙酰化组蛋白提供了一个招募平台作用，与非组蛋白靶点相关，除与病毒蛋白复合外，还参与NFKB信号转导、Myc调控。此外，BRD4还与其它bromodomain蛋白存在协同作用，其中一些还可能执行泛素化功能。另有一位作者使用QE HFX质谱描述了BRD4相互作用蛋白的分子表型，使用了经BET抑制剂、与BRD4结合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白处理的人类B细胞系蛋白质组。结果发现，已鉴定的蛋白定位于SARS-CoV-2病毒感染细胞的相互作用重编程途径和复合物中[2]，如下图所示。

图. 蛋白组学分析SARS-CoV-2病毒感染细胞后BRD4相关互作蛋白

2.2. Q Exactive HF质谱非标定量技术监控病毒感染细胞实时变化

法国巴黎萨克利大学团队，通过使用Thermo ScientificTM Orbitrap Q Exactive HFTM质谱进行niao枪法蛋白质组学研究，获得了 SARS-CoV-2感染的相关信息，确定了病毒颗粒抗原产生的jia条件。技术流程如下图所示。

作者用SARS-CoV-2感染Vero E6细胞（MOI 0.01和0.001）。然后用LFQ（非标记定量方法）方法在几天内监测感染的实时变化。总共鉴定了3220个Vero细胞蛋白和6个SARS-CoV-2蛋白，以及27388个Vero细胞和94个病毒特异肽段（FDR<1%）。病毒蛋白水平在不同时间点的动态变化表明，SARS-CoV-2蛋白合成在感染后持续增加，在感染第3天左右达到大值。为了评估质谱获得的病毒图谱在多大程度上反映了病毒的产生，作者通过qPCR在同一时间点测量了SARS-CoV-2 RNA分子，观察到了极为丰富的病毒蛋白产量的变化[3]，从而证实可以使用基于质谱的LFQ非标定量法监测SARS-CoV-2的感染动力学。

图. Q Exactive HF质谱进行niao枪法蛋白质组学研究SARS-CoV-2感染的相关蛋白

3. Orbitrap高分辨质谱针对xin冠病毒糖蛋白结构研究进展

3.1. Orbitrap Fusion质谱结合冷冻电镜解析SARS-CoV-2 S糖蛋白多糖结构

来自CCRC的Robert Woods实验室通过大量实验生成了 SARS-CoV-2 S糖蛋白上的聚糖三维结构。整个研究基于所报道的S蛋白3D结构和相关的糖组学数据[4]，由赛默飞冷冻电镜Cryo_EM 以及Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM 质谱结合分析。

他们进行了分子动力学模拟，以观察多糖的微观异质性对表位暴露的影响。模糊位置为聚糖结构。M9型（绿色），M5型（深黄色），混合型（橙色），复合型（粉色）。

图. SARS-CoV-2 S糖蛋白聚糖结构和多糖微观异质性

3.2. Orbitrap Fusion Lumos质谱绘制xin冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白糖基化图谱

xin型冠状病毒（SARS-CoV-2）中的刺突蛋白（Spike蛋白）是一种高度糖基化的蛋白质，是病毒结合和进入宿主细胞的关键调节因子，也是研发抗体及相关药物的关键靶点。该蛋白的位点特异性N-糖基化修饰（包含糖基化位点和糖链信息）分析对于了解其功能和药物研发具有重要意义。四川大学华西医院科研团队针对该蛋白的位点特异性N-糖基化修饰进行深入分析[5]，具体实验流程如下。

图. 利用Orbitrap质谱分析xin冠病毒S蛋白N-糖基化流程

 通过使用Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM LumosTM质谱技术的整合糖蛋白质组学新方法，绘制了xin冠病毒SARS-CoV-2重组表达蛋白的所有N糖基化修饰位点以及位点特异性的N-糖链组成图谱，如下图所示。

图. S糖蛋白位点特异性N糖基化位点修饰谱

4. 蛋白质组结合代谢组研究xin冠病毒感染病人血清生物标志物

多组学方法研究xin冠肺炎轻重症患者血清中蛋白和代谢生物标志物

西湖大学生命科学学院与合作团队对xin冠肺炎患者血液中的蛋白质和代谢物分子进行系统检测，利用多组学方法研究重症患者血清的多种蛋白和代谢物分子表型，寻找潜在生物标志物，有望为预测轻症患者向重症发展提供导向。

实验对99例病毒灭活处理的血清样本进行了安全处理和Orbitrap质谱分析。根据现行临床诊断标准，样本被分为对照（健康）组、普通流感组、xin冠感染轻症组、xin冠感染重症组。运用QE HF质谱对血清样本中的蛋白质和代谢物的相对浓度进行整体分析[6]，揭示重症患者体内多种分子调控，具体流程如下图所示。

图. 蛋白质组学结合代谢组学围绕xin冠肺炎患者队列进行分析流程

与对照（健康）组、普通流感组和轻症组相比，xin冠肺炎重症患者的样本中出现了93种*的蛋白表达和204个特征性改变的代谢分子。其中50种蛋白，与患者体内的巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒有关。研究团队还发现，在xin冠病毒感染的重症患者体内，有100多种氨基酸及100多种脂质均显著减少。见下图。

图. COVID-2019感染后重症患者体内的巨噬细胞等通路蛋白质和代谢物变化

基于Orbitrap质谱技术和机器学习分析方法，短时间内整合蛋白质组、临床、生物、代谢组、计算等多学科数据筛选出重症患者特征性的22个蛋白质和7个代谢物，有望可以辅助现有的诊断分析手段，实现更精准、高效的治疗。

xin型冠状病毒肺炎疫情来势汹汹，牵动着每一个人的心，在这没有硝烟的抗疫战场上，白衣天使和医学研究者都是勇敢的战士。赛默飞也在以自己的力量全力支持国内的xin冠病毒科学研究，我们整理了基于Orbitrap超高分辨质谱技术在xin冠病毒相关的亮点研究，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者们，默默付出，勇敢向前。

参考文献

[1] TARGETED PROTEOMICS FOR THE DETECTION OF SARS-COV-2 PROTEINS,  https://www.biorxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.23.057810v1

[2] A proteomic model of SARS-COV2 infection by comparing the interactomes of BRD4 with BET-inhibition and SARS-COV2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidates，DOI:10.21203/rs.3.rs-24573/v1

[3] Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, https://www.biorxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.17.046193v1

[4] 3D Models of glycosylated SARS-CoV-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.030445

[5] Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins using High-Resolution Mass Spectrometry, https://doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.

[6] Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-2019 Patient Sera, https://www.medrxiv。。ｏｒｇ/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1

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