产品推荐:气相|液相|光谱|质谱|电化学|元素分析|水分测定仪|样品前处理|试验机|培养箱


化工仪器网>技术中心>仪器文献>正文

欢迎联系我

有什么可以帮您? 在线咨询

用水浴锅做肿瘤细胞软克隆实验

来源:上海喆图科学仪器有限公司   2018年12月12日 11:49  

 

        在传统的软琼脂克隆形成试验中,细胞生长在上层含有细胞培养基的软琼脂中,下层软琼脂也与细胞培养基混合,但含有较高浓度的琼脂。这可以防止细胞贴附在培养板上,还可以使转化细胞形成可见的菌落。这种技术的原理是正常细胞依靠细胞与细胞外基质的接触才能生长和分裂,相反,不管周围环境如何,转化细胞均具有生长和分化的能力,因此能够以锚定独立的方式形成菌落的细胞被认为是转化和致癌的。下面喆图小编介绍一种用水浴锅做相关实验的方法,这种方法的总体目标是以半定量和严格的方式测定细胞的这种能力。

 

        实验操作:

准备材料和试剂:

1、配制2×培养基:1 g培养基粉末,0.2 g碳酸氢钠,加入去离子水,定容到50 mL。

2、将培养基经0.2 μm滤膜过滤除菌。

3、加入目标细胞所需培养基的其他成分。例如:用RPMI 1640培养基培养CMT 167细胞需要加入10% FBS,1% 青霉素/链霉素。使用之前将培养基放在37°C水浴锅

4、配制1×培养基,依照目标细胞生长所需培养基配制。

5、配制1%琼脂:1 g琼脂加入到100 mL去离子水中。

6、配制0.6%琼脂:0.6 g琼脂加入到100 mL去离子水中。

7、将配好的琼脂经高温高压灭菌,灭菌后可放在4°C保存,使用前加热至*溶解。

8、配制氯化硝基四氮唑蓝试剂:1 mg/mL氯化硝基四氮唑蓝加入到1×PBS中。

 

        铺下胶:

1、将熔化的1%琼脂溶液和预热的2×培养基放入装满热水(42°C)的桶(或水浴锅)中,在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。

2、6孔板中的每个孔需要加入1.5 mL混合的琼脂和培养基,为保证足够的量,一个6孔板准备12 mL。

3、首先加入6 mL的培养液到50 mL的锥形管,再加入6 mL的1%琼脂溶液。将锥形管多次翻转混匀,每个孔中迅速加入1.5 mL混合液,加混合液时不能产生气泡。

4、室温静置30 min,待下胶凝固。

 

        铺上胶:

1、收获的细胞用胰蛋白酶消化,用培养基以1:5的比例稀释(如1 mL胰蛋白酶,加4 mL培养基),放入15 mL锥形管。

2、细胞计数:以每孔5000个细胞作为起始,并根据需要进行调整。

3、细胞悬浮液的体积需要1.5 mL。一个6孔板准备12 mL细胞悬液。

4、将熔化的0.6%琼脂溶液放入装有热水(42°C)的桶中,在热水里放一个50 mL的锥形管。将桶放入超净台内。

5、以1:1的比例混合0.6%琼脂溶液和细胞悬液,吸取6 mL细胞悬浮液到50 mL锥形管,再加入6 mL的0.6%琼脂溶液。混匀后迅速加入6孔板中,每孔1.5 ml。小心避免产生气泡。

6、室温静置30 min,待上胶凝固后放入细胞培养箱

7、足够的菌落形成所需的时间因每个细胞系而异,通常为21天左右。每星期加两次100 g的培养基以防止干燥。

        以上内容仅供参考,详情请咨询上海喆图。

免责声明

  • 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
企业未开通此功能
详询客服 : 0571-87858618