温育是ELISA测定为要害、简单出现问题的步骤。为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。目前国内售ELISA 试剂盒温育时刻为37℃，30 min~1 h，进口ELISA试剂盒则一般为37℃，1～2 h 能有较*的结合。  
温育时刻、温度的挑选一般依据试剂盒的说明书挑选温育的时刻、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃ 需求一定时刻，如果是将微孔板一放入温箱即开端计时，这样就简单形成实际测定中温育时刻不行，易致弱阳性标本测不出来。
操控办法：
①如有两种温度，尽量使 用较低的温育温度、较长反响时刻的条件；
②用1个小温度计放置在板孔反响液中丈量观察。外周孔显色较中心孔深的现象。发生的原因可能是为96 孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度形成的，因此在温育时尽量采用水浴。

孵育前加样时刻过长，酶试剂加出孔外，运用滴瓶滴加试剂时，滴加的视点不同和揉捏的力度 不同，致使滴加的试剂量禁绝，都可导致实验结果禁绝确。
操控办法：
①实验样本过多时，可分批次操作，以削减实验时刻延伸形成的差错；
②加酶试剂后，用吸水 纸吸干孔外试剂；
③作定量实验时，运用加样器加注试剂，并常常校对其性，此外，要做到一份样本一个移液头，避免穿插污染。