1、简介
重叠PCR也是基本的PCR原理:变性-退火-延伸。不同的是在重叠PCR过程是两个或者几个片段重叠延伸之后,再进行指数扩增的PCR过程。
2、基本原理
*步:PCR产生两个或者几个片段,这几个片段之间必须有重叠区。
第二步:以两个片段为例,见上图,*步产生的两个片段,A D链之间有互补,B C链之间也有互补,但只有A D链互补重叠延伸产生所需要的重叠片段。
第三步:第二步产生的重叠产物,在上下游引物的存在下,即可进行PCR扩增过程。 请仔细看清楚原理,特别是第二步。
3.实际操作注意点
a.*步PCR之后的产物,可以纯化,也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。
b.第二步和第三步一起称为重叠PCR,实际发生过程分为两个步骤。
c.Taq酶会在末端加A,高保真酶有3’— 5’的外切活性,基于重叠PCR原理和酶的性质,*步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶(或者如Taq Plus、EsTaq之类的,有3’— 5’的外切活性),如果*步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。
d.基于重叠PCR原理,上图中第二步A D 链直接的退火很关键,所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行也是基于以上原理。重叠区的Tm很关键,或者说退火温度很重要。
4.重叠PCR几个应用场景
.片段中间引入突变
b.片段中间引入缺失
C.片段中间引入插入片段
d.片段拼接(如不同结构域DNA pian段拼接)
e.长片段分段扩增,再重叠PCR拼接
f.从基因组扩增出外显子,再拼接出完整的CDS区
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