产品推荐:气相|液相|光谱|质谱|电化学|元素分析|水分测定仪|样品前处理|试验机|培养箱


化工仪器网>技术中心>操作使用>正文

欢迎联系我

有什么可以帮您? 在线咨询

免疫共沉淀操作步骤

来源:上海希言科学仪器有限公司   2018年01月19日 10:34  

具体步骤  
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次,zui后洗涤完成后吸干PBS液。  
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)。  
3. 刮留细胞:用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下,将悬液转入1.5mlEP管中,EP管插冰上,置于水平摇床上缓慢晃动15min。  
4. 4℃,14000g离心15min。  
5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。  
6. 准备Protein A琼脂糖,用PBS液洗两遍珠子,然后用PBS液配制成50%浓度。  
*为避免操作中破坏琼脂糖珠,减掉移液器枪头的尖部分。  
7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠(50%),EP管插冰上,置于水平摇床上4℃摇晃10min。  
*目的是去除非特异性杂蛋白,可降低背景。  
8. 4℃,14000g 离心15min,将上清转移到一个新的离心管中。  
9. 测定蛋白浓度,可选用Bradford法做蛋白标准曲线。  
10. 蛋白定量,分装,-20℃保存,可保存1个月。  
11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。  
12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。  
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物,可选择过夜或室温放置2h。  
14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物,摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。  
15. 14000rpm瞬时离心5s,去上清,收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。  
16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。

17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻敲打混匀。  
18. 将上样样品煮5min。  
19. 14000g离心,收集剩余琼脂糖珠。  
20. 将上清电泳,电泳前应再次煮5min变性。  
21. 上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳。   
基础成分  
(1)Tris-HCl(防止蛋白变性的缓冲液成分)  
(2)NaCl(防止非特异性蛋白聚集的盐分)  
(3)NP-40(用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂,用于提取蛋白)  
(4)去氧胆酸钠(用H2O配置成10%储存液;提取蛋白用离子去污剂;避光保存)  
*因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失,准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠。

免责声明

  • 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
企业未开通此功能
详询客服 : 0571-87858618