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内毒素的检测和去除

来源:上海希言科学仪器有限公司   2018年01月18日 12:11  

1 内毒素及其来源   
1.1 内毒素  
内毒素(endotoxin)是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质,一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中,特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。内毒素又被称为热原,是一种脂多糖物质,具有耐热性,不易被去除。若疫苗中存在一定浓度的内毒素,接种动物后,可引起动物发热,休克等,严重时甚至造成死亡。   
1.2 内毒素的来源 
因为革兰氏阴性菌无处不在,所以内毒素几乎存在于任何地方。在疫苗生产中一定要重视和尽可能减少内毒素的污染。 
生产用水中内毒素的含量是导致疫苗安全性的关键因素之一。大量研究表明,疫苗生产过程中内毒素主要来源于培养液和配制用水,其在贮存过程中易受到革兰氏阴性菌的污染。贮水罐,纯水系统的过滤器和连接管道,以及培养液容器等都可能受到革兰氏阴性菌的污染。  工作人员进出车间携带的物品,以及空气净化系统久不维护,都有可能造成生产车间内的空气尘埃浓度升高,导致内毒素污染。 
生产用具、管道、泵、阀门、滤器等的清洗消毒不*也会造成内毒素污染。生产原料的污染,如血液制品,细胞培养基。人为操作不规范也会引起内毒素污染。   
2 内毒素的检测 
目前,内毒素的检测方法较多,但是各存在利弊,因此,选取检测方法要根据实际需求,不建议采取单一的检测方法。  
 
2.1 鲎试验法 
鲎试验法是通过酶的级联反应而实现,内毒素在二价阳离子的参与下激活C因子(FC),然后激活其它酶原,产生一系列凝集酶反应。该方法是目前检测内毒素zui特异和zui灵敏的方法。  
2.2 重组C因子法  
重组C因子法是使用一个单一的蛋白(重组C因子)作为有效活性成分。反应中内毒素激活重组C因子,活化的重组C因子将荧光底物裂解,产生荧光复合物,定量检测荧光复合物来量化内毒素。这种方法可有效避免假阳性的产生。该方法可用于药品生产,环境,器械生产中的内毒素检测。  
2.3 热原试验法 
该方法是比较广泛的检测热原的方法,利用微量内毒素可引起动物体温升高的特性来测试其含量。这种方法存在灵敏度低,无法定量测定,种属差异大,周期长等问题。  
2.4 其它方法   
除了上述较常见的方法外,还有一些方法也被应用于内毒素的检测,如免疫学方法(酶联免疫吸附检测法,火箭免疫电泳鲎试验法,双抗体夹心ELISA法等),生物学方法,化学发光法,流式细胞法,液相色谱法等。  
3 内毒素的去除 

一直以来,去除内毒素都是疫苗生产中的一个难题。其热稳定性高,对PH值不敏感。目前,已有一些去除内毒素的方法,但其去除方法还有待进一步研究。  3.1 超滤法 
利用内毒素与其他物质的分子量的差别来去除内毒素。一般在样品流经超滤膜时,超滤膜将内毒素截留在膜上,而让其它低分子量物质透过,从而有效控制内毒素的含量。超滤膜的内毒素去除率较高,变化范围较宽,高达98.7%,低至53.3%。因热原是一类形态和相对分子质量均不确定的物质,其种类,浓度也会有所不同,因此内毒素的去除率也是由多种因素所决定,如超滤运行的压力,超滤浓缩的倍数,超滤洗脱的体积等。由于内毒素聚合体可能会在高温或酸性环境中分解,进而造成内毒素分子的真正毒性部分类脂A穿过滤膜而进入滤液中。该方法去除内毒素,抗原损失较少,并且富集样品,能够满足疫苗生产的要求。  
3.2 活性炭法 
该方法主要适用于水等组分简单的小分子溶液的内毒素去除。因其选择性能差,易吸附有效成分,一般较少用。该方法可与超滤法联合使用去除内毒素的效果较佳。  
3.3 热处理法 
该方法主要用于耐热物品内毒素的去除。  
3.4 化学降解法 
使用强酸,强碱或氧化剂使内毒素自身降解,从而去除内毒素。  
3.5 亲和膜分离系统法 
此法基于亲和色谱法,以纤维素膜等做基础材料,通过化学的方法键合不同的配基,这些配基对内毒素分子或聚集体有较强的吸附作用。此法吸附特异,吸附量大,去除率高,膜可再生,且具备一定的耐酸耐碱性。  
3.6 其它方法 
吸附技术和双向萃取法也用于去除内毒素,但这两类方法涉及的试剂,步骤较多,易造成污染,使用较少。

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