维生素B1测定操作步骤和注意事项

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来源：广州佳途科技股份有限公司 2018年01月11日 13:36

　　维生素B1测定操作步骤

　　1样品制备

　　样品采集后用匀浆机打成匀浆于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。干燥样品要将其尽量粉碎后备用。

　　2提取

　　2.1称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10~30μg，一般称取2~10g试样)，置于100ml三角瓶中，加入50ml0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解121℃30min，凉后取出。

　　2.2用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。

　　2.3按每克样品加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45~50℃温箱过夜保温(约16h)。

　　2.4凉至室温，定容至100ml，然后混匀过滤，即为提取液。

　　3净化

　　3.1用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

　　3.2用移液管加入提取液20~60ml(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2~5μg)。

　　3.3加入约10ml热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。

　　3.4加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20ml，收集此液于25ml刻度试管内，凉至室温，用25%酸性氯化钾定容至25ml，即为样品净化液。

　　3.5重复上述操作，将20ml硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。

　　4氧化

　　4.1将5ml样品净化液分别加入A、B两个反应瓶。

　　4.2在避光条件下将3ml15%氢氧化钠加入反应瓶A，将3ml碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10ml正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。

　　4.3重复上述操作，用标准净化液代替样品净化液。

　　4.4静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2~3g无水硫酸钠使溶液脱水。

　　5测定

　　5.1荧光测定条件：

　　激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。

　　5.2依次测定下列荧光强度：

　　a.样品空白荧光强度(样品反应瓶A)；

　　b.标准空白荧光强度(标准反应瓶A)；

　　c.样品荧光强度(样品反应瓶B)；

　　d.标准荧光强度(标准反应瓶B)；

　　维生素B1测定的注意事项

　　1、加热酸性氯化钾而不使其沸的原因是热氯化钾滤速较快，而不沸则是使其不至因过饱和而在洗涤中结晶析出阻塞交换柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化钾中极其稳定，可保存一周以上。

　　2、硫胺素在碱性环境中被铁氰化钾氧化成噻嘧色素，振摇15s是使其充分反应，这期间应保证黄色不退证明铁氰化钾量充足不被其它还原性杂质耗尽，而强碱又可破坏硫胺素，所以除加入碱性铁氰化钾时边摇匀边加入外，其加入量一定不能过多，否则硫胺素被破坏。

　　3、对每个样品所加试剂的次序、快慢、振摇时间等都必须尽量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素时必须保证准确振摇90s。

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