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菌种的保存

来源:上海希言科学仪器有限公司   2017年12月26日 10:43  

1 斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至 2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 2—4 个月,移种一次。酵母菌两个月,细菌每月移种一次。

2 液体石蜡保藏法

  1. 将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌 30 分钟,然后放在 40℃温箱中,使水汽蒸发掉,备用。
  2. 将需要保藏的菌种,在zui适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体或孢子。
  3. 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端 1cm 为准,使菌种与空气隔绝。
  4. 将试管直立,置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。

3 滤纸保藏法

  1. 将滤纸剪成 0.5×1.2cm 的小条,装入 0.6×8cm 的安瓿管中,每管 1—2 张,塞以棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌 30 分钟。
  2. 将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使充分生长。
  3. 取灭菌脱脂牛乳 1—2ml 滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。
  4. 用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。
  5. 将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干。
  6. 将棉花塞入管内,用火焰按图Ⅶ-13 熔封,保存于低温下。
  7. 需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。

4 沙土保藏法

  1. 取河沙加入 10%稀盐酸,加热煮沸 30 分钟,以去除其中的有机质。
  2. 倒去酸水,用自来水冲洗至中性。
  3. 烘干,用 40 目筛子过筛,以去掉粗颗粒,备用。
  4. 另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性。
  5. 烘干,碾碎,通过 100 目筛子过筛,以去除粗颗粒。
  6. 按一份黄土、三份沙的比例(或根据需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)掺合均匀,装入 10×100mm 的小试管或安瓿管中,每管装 1g 左右,塞上棉塞,进行灭菌,烘干。
  7. 抽样进行无菌检查,每 10 支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中,37℃培养 48 小时,若仍有杂菌,则需全部重新灭菌,再作无菌试验,直至证明无菌,方可备用。
  8. 选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的,营养细胞用此法效果不好)优良菌种,以无菌水洗下,制成孢子悬液。
  9. 于每支沙土管中加入约 0.5ml(一般以刚刚使沙土润湿为宜)孢子悬液,以接种针拌匀。
  10. 放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽干时间越短越好,务使在 12 小时内抽干。
  11. 每 10 支抽取一支,用接种环取出少数沙粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和有无杂菌生长,如出现杂菌或菌落数很少或根本不长,则说明制作的沙土管有问题,尚须进一步抽样检查。
  12. 若经检查没有问题,用火焰熔封管口,放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。
  13. 需要使用菌种,复活培养时,取沙土少许移入液体培养基内,置温箱中培养。

5 液氮冷冻保藏法

  1. 准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,要求能耐受温度突然变化而不致破裂,因此,需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用 75×10mm 的,或能容 1.2mm 液体的。
  2. 加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时,则将空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌 15 分钟:若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如 10%的甘油蒸馏水溶液或 10%二甲亚砜蒸馏水溶液,加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限,而后再用1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌 15 分钟。
  3. 接入菌种将菌种用 10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安瓿管内,然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
  4. 冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降 1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻,则在细胞内会形成冰的结晶,因而降低存活率。
  5. 保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃,液态氮内为-196℃。
  6. 恢复培养保藏的菌种需要用时,将安瓿管取出,立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻,直到全部融化为止。再打开安瓿管,将内容物移入适宜的培养基上培养。

​6 冷冻干燥保藏法

  1. 准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安瓿管(图Ⅶ-15),大小要求外径 6—7.5mm,长 105mm,球部直径 9—11mm,壁厚 0.6—1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌 30 分钟,备用。
  2. 准备菌种,用冷冻干燥法保藏的菌种,其保藏期可达数年至十数年,为了在许多年后不出差错,故所用菌种要特别注意其纯度,即不能有杂菌污染,然后在zui适培养基中用zui适温度培养,使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活率反而降低。一般,细菌要求 24—48 小时的培养物;酵母需培养 3 天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养 7—10 天。
  3. 制备菌悬液与分装以细菌斜面为例,用脱脂牛乳 2ml 左右加入斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装 0.2ml。
  4. 冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售,价值昂贵,此处介绍的是简易方法与装置,可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体 CO2>)酒精液或干冰丙酮液,温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻 4—5 分钟,即可使悬液结冰。
  5. 真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态,需准备冷冻槽,槽内放碎冰块与食盐,混合均匀,可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16,安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在 30 分钟内能达到 93.3Pa(0.7mmHg)真空度时,则干燥物不致熔化,以后再继续抽气,几小时内,肉眼可观察到被干燥物已趋干燥,一般抽到真空度 26.7Pa(0.2mmHg),保持压力6—8 小时即可。封口抽真空干燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用 形五通管(图Ⅶ-17)继续抽气,约 10 分钟即可达到 26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后,保存于冰箱或室温暗处。

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