蛋白测定提纯定氮仪操作步骤 概述

蛋白质的测定方法，目前仍以1883年凯达尔氏(Kiedahl)发明的定氮法为基础，它根据各种蛋白质都具有固定比数的氮这一事实，通过对氮的测定而推算出蛋白质含量，此法所得的含氮量除了确定属于蛋白质组成成分的氮以外，还包括非蛋白质组成的其他有机及无机态氮，所以换算所得的蛋白质含量称作为粗蛋白含量，一般蛋白质中的含量为18%，换算后即每6.25克蛋白质中含有1克氮，因此6.25成为换算系数K，但是不同的农产品及其制品的实际含氮量有区别，所以不同农产品必须采用不同的换算系数，如花生、大豆、蚕豆、大麦、小麦、燕麦、黑麦等含氮为17.6%，求得K=5.7，荞麦、葵花籽、亚麻籽、籽、棉花籽、蓖麻籽等换算系数则为K=5.50，玉米、菜籽为6.00，水稻为5.95，上述以外的其他农产品的换算系数均适用6.25。尽管如此，目前世界上还没有直接分离测定含蛋白质的可行方法。因此，迄今为止在国内外凯氏定氮法仍然是测定蛋白质含量的经典方法。所得结果准确、稳定。

我公司研制生产的KDN系列定氮仪（蛋白质测定仪），是引进消化吸收国内外检测新技术，结合我国国情，应用凯氏定氮法原理，采用化学与物理学相结合完成的成套蛋白质含量快速测定装置。为粮食、食品、饲料、农业、商检等检测部门提供了理想的检测设备。

二、 工作原理

KDN系列定氮仪检测原理为：

整套装置，由电加热消化器、蒸馏器两部分组成。要提高蛋白质含量测定的检测速度，其关键是要加速样品消化煮解的时间（40分钟左右），KDN系列定氮仪消化装置采用井式电加热炉，增大了消化管受热面，使消化管连同管内所注入的10ml H2SO4及试样置入消化管插入井式炉内加热取得更佳的热效应，在消化前置入硒片作为催化剂进一步加速消化煮解，大大缩短消化时间。消化管内溢出的SO2等有害气体，通过消化管上的排污管经抽吸泵由水带入下水道，有效的抑制有害气体的外逸，由省略了实验室中安装毒气通风橱，试样经40分钟左右消化煮解，即可*消化。

消化的过程主要反应如下：

R•C•H•NH2•COOH （蛋白质）+ H2SO4 → CO2 + SO2 + NH3 + H2O

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

蒸馏与吸收过程的主要反应如下：

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

NH3 + 4H3BO3 → NH4HB3O7 + 5H2O

然后经滴定，计算蛋白质含量，滴定的过程是盐酸和硼酸氢铵反映的过程。

NH4HB3O7 + HCl + 5H2O → NH4Cl + 4 H3BO3

三、 技术参数

1． 测定品种：粮食、食品、饲料、酿造、土壤、制糖、乳制品、药物等物质

2． 测定范围：含氮量0.05%~90% ( 0.1~200mg)

3． 测定数量：消化：一次同时消化个数按炉孔数定；单个蒸馏

4． 测定时间：消化每批45min；蒸馏每个6min

5． 测定重现性：平行试验结果符合GB/T 6423-94

6． 电源：220V，50Hz

四、 使用说明

1． 其他仪器和用具

1．1分析天平：感量0.0001g

1．2实验室用粉碎机或研钵

1．3酸式滴定管：25ml或10ml

1．4锥形瓶：容积250ml

1．5分样筛：孔径0.45mm(40目)

2．试剂

2．1盐酸(HCl)：分析纯(GB622) 0.05mol/L标准液，(4.2ml盐酸，注入1000ml蒸馏水)碳酸钠法标定盐酸。

2．2氢氧化钠(NaOH)：化学纯或工业纯(GB629)、40g溶于蒸馏水中溶成100ml，配成40%水溶液(m/v)。

2．3硼酸(H3BO3)：分析纯(GB628)2g，溶于蒸馏水中配成100ml 2%水溶液(m/v).

2．4混合指示剂：甲基红(G5H15N3O2)(HG3-958)溶于乙醇配成0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿(HG3-1220)溶于乙醇配成0.5%乙醇溶液，二种溶液等体积混合，阴凉处保存(保存期三个月以内)。

2．5硫酸铜(CuSO4•5H2O)分析纯(GB655)10g；硫酸钾(K2SO4) (HG3-920)分析纯150g，在研钵中研磨，仔细混匀后过40目筛(加速剂)。（催化剂可以代替有毒的硒）

2．6浓硫酸(H2SO4)化学纯(GB625)(含量98%、无氮)。

3．操作方法

3．1样品消化

称取经粉碎通过40-60目/寸试样0.5-1g(视含量而定)无损的置入已洗涤烘干的试管中加催化剂一片和10ml硫酸。

将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，开启抽吸泵水阀，使抽吸泵处于吸气状态。接通电源，再加热初始阶段需注意观测，防止试样因急沸而飞溅。(初化时，电压调至150V左右温度不宜太高。)

3．2蒸馏

KDN系列蒸馏器蒸馏时，碱液及蒸馏水采用电磁泵加液置入方法，因而避免了活塞中漏液现象，NaOH、H2O注入接口，橡胶管套入后分别置入NaOH、H2O盛器桶内，加液时按面板上相应开关，液体经电磁泵自动流入消化管内注入毫升数视标尺所注位置而定。

1．蒸馏器预热：打开自来水，夹紧排水管、蒸汽开关，同时打开黄色进水开关待电流打开表指针指示在2A-3A时马上关闭黄色进水开关，待蒸汽管喷出气后打开黄色进水开关，半分钟后电流表稳定在3.5-时关闭蒸汽开关，这一步只在刚开机时预热。

2．在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示剂，并使接收瓶托盘往上移动。

3．扳动蒸馏托盘架把消化管固定在蒸馏器托盘上，然后按面板上H2¬O、NaOH开关，分别向消化管内注入蒸馏水和氢氧化钠溶液，然后开启蒸汽开关，向试管内注入蒸汽，进行蒸馏，在接收液在150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗出气口继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。其他消化好样品可重复这一步进行蒸馏即可，不再需要预热。

3．3滴定

用标定后的盐酸溶液进行滴定接收瓶内的溶液，滴定溶液由绿色变为淡紫色为终点，记下消耗盐酸溶液的毫升数，按下式计算蛋白含量：

蛋白含量(%)=式中：V2—滴定试样时消耗酸标准溶液的体积 (ml)

      V1—滴定空白时消耗酸标准溶液的体积 (ml)

      C—标准酸溶液的摩尔浓度

      0.014—氮的毫克当量数

      K—氮换算成粗蛋白质的系数

      W—试样重量 (g)

(空白测定：用0.1克糖代替样品或不加样品做空白测定)

平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后二位。

3．4 换算系数

结果报告中必须注明氮换算成粗蛋白质的系数，换算系数见下表。

样品名称 换算系数 数据来源

小麦 5.70 GB2905

大麦 5.70 GB2905

酿酒大麦 6.25 TOCT10846

面粉 5.70 GB5009.5

面包 5.70 AOAC14.103

大豆 6.25 GB2905

5.71 GB5009.5

玉米 6.25 食品常用数据手册

6.24 GB5009.5

饲料 6.25 GB6432

肉制品 6.25 GB5009.5

乳制品 6.38 GB5009.5

牛奶 6.38 ACAC16.036

芝麻 5.30 GB5009.5

油菜 5.53 油菜籽综合利用

3．5注意事项

1．消化时若有气体外溢，加大抽吸泵水的流速。

2．NaOH溶液因长期不用，管内容易产生粘固现象，每天工作完毕把NaOH外接皮管，一如蒸馏水瓶内，抽洗几次，待下一次使用时，在蒸馏时需排出100mlNaOH，以防稀释NaOH。

3．每次试样蒸馏结束，必须迅速取下消化管，防止消化管液体倒吸至蒸发炉内腐蚀电极板。

4．用户在遵守本仪器的运输、贮存、安装、调整和使用规程的条件下，如发现仪器因制造质量问题而不能正常工作时，从收获之日起一年内实行三包；或开箱时发现包装不良而发生损坏，附件与装箱单不符，短缺零件等情况，请与我公司质检部门。来函注明产品型号、编号和出厂日期。本仪器使用时，要求用户严格按照说明谁规定进行，如有疑问或对结构改进的意见，请来函告知我公司质检部门。