胰糜蛋白酶的分离纯化
胰蛋白酶在医药、食品、工业和有机合成中具有广泛应用。临床上可用于抗炎症和消化药物的复配;食品加工中用于酒类和饮料的澄清、畜蛋白原的水解、胰蛋白胨的制备和除去乳品在贮藏时氧化产生的味道;工业上用于皮革加工和生丝处理。糜蛋白酶为胰腺分泌的重要蛋白质水解酶,能迅速分解蛋白质,消化溶解变性蛋白质。临床用于多种疾病的治疗,并取得良好效果,如颅内感染性炎症、呼吸系统感染及炎症、消化系统的感染及炎症等。因此,胰糜蛋白酶的纯化研究具有重要的经济和技术意义。
蓝晓科技(股票代码:300487)生命科学事业部致力于开发、生产生物分子分离纯化用层析介质,拥有琼脂糖、葡聚糖、高分子聚合物三种基架的凝胶过滤、离子交换、疏水、亲和等各种层析介质百余种。目前,工业上对于胰糜蛋白酶的纯化,常用离子交换层析介质和亲和层析介质。本次实验针对蓝晓科技生产的seplifeR离子交换层析介质和seplife R亲和层析介质进行胰糜蛋白酶的纯化工艺探究。
一.亲和层析工艺
Benzamidine seplife 4FF是蓝晓科技研发生产的一款亲和层析介质,专门用于胰糜蛋白酶的分离。该层析介质对胰蛋白酶有特异性吸附,吸附载量大于35mg/mL,对糜蛋白酶吸附小于3mg/mL,且实验条件对胰糜蛋白酶的活性无影响。
1、 色谱条件:
色谱柱:26*20 ;装柱高度:10 cm;流速:5 ml/min;
缓冲液A:Tris-HCl + NaCl;
缓冲液B:Tris-HCl;
样品说明:胰糜蛋白酶含量相当,有少量杂质。
2、色谱图
- 结果分析
分别对原液、流穿液、洗脱液中蛋白浓度和胰糜蛋白酶的效价进行测定。蛋白浓度通过紫外吸收法,效价测定根据中国药典2015年版胰糜蛋白酶的效价测定方法。
项目 | 糜效u/mg | 胰效价u/mg |
上样液 | 1109 | 990.81 |
流穿液 | 1447.46 | 0 |
洗脱液 | 0 | 2660.38 |
中国药典2015年版规定糜蛋白酶的效价不小于1000单位/mg;胰蛋白酶效价不得少于2500单位/mg。由此可以看出蓝晓科技开发生产的Benzamidine seplife 4FF亲和层析介质可以用来生产满足药典要求的胰蛋白酶和糜蛋白酶。
二.离子交换层析工艺
CM Seplife FF是蓝晓科技开发生产的一款弱阳离子交换层析介质,吸附载量可达60mg溶菌酶/mL介质,质量稳定,蛋白活性回收率高。
1.色谱条件:
色谱柱:26*20 ;装柱高度:10 cm;流速:5 ml/min;
缓冲液A:HAc-NaAc;
缓冲液B:HAc-NaAc + NaCl;
样品说明:客户提供的粗提液,含较多杂质,糜蛋白酶含量高,胰蛋白酶含量低。
2.色谱图
3、结果分析
分别对原液、流穿液、洗脱液1,2,3中蛋白浓度和胰糜蛋白酶的效价进行测定。蛋白浓度通过Bradford法测定,效价根据中国药典2015年版胰糜蛋白酶的效价测定方法。
项目 | 糜效u/mg | 胰效价u/mg |
上样液 | 1109 | 990.81 |
流穿液 | 1447.46 | 0 |
洗脱液 | 0 | 2660.38 |
三.小结
流穿液中全为杂质,洗脱峰一为杂蛋白,洗脱峰二为糜蛋白酶,洗脱峰三为胰蛋白酶。糜蛋白酶效价满足要求的纯化后不少于1200单位/mg。由此可见,CM Seplife FF对胰糜蛋白酶也能达到良好的分离效果,可用于生产满足药典要求的糜蛋白酶。
通过以上实验可以看出,在实际生产过程中,蓝晓科技开发生产的Benzamidine seplife 4FF、CM Seplife FF均可用于胰糜蛋白酶的分离纯化,具体选择要根据样品情况而定。另外,不同的缓冲液体系对分离效果也有影响。(除了Benzamidine seplife 4FF、CM Seplife FF,蓝晓科技开发生产的DEAE Seplife FF也可用于胰糜蛋白酶的分离纯化,该部分内容将于下期继续介绍。)
相关产品
免责声明
- 凡本网注明“来源:化工仪器网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:化工仪器网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源(非化工仪器网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。