S8APO徕卡显微镜的分辨率如何计算？

S8APO徕卡显微镜的分辨率如何计算？

S8APO徕卡显微镜的分辨率如何计算？

在显微术中，术语“分辨率”用于描述显微镜区分细节的能力。换句话说，这是通过观察者或显微镜摄像机仍然可以看到样本的两个不同点的小距离 - 作为单的实体。

显微镜的分辨率与光学部件的数值孔径（NA）以及用于检查样品的光的波长本质上相关。此外，我们必须考虑由恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）于1873年描述的衍射极限。

本文涵盖了这些概念背后的一些历史，并解释每个使用相对简单的术语。

分辨率和数值孔径

数字孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜（NA = n x sinα）的角孔径（α）有关。显微镜的分辨率不仅仅取决于物镜的NA，而是考虑到显微镜聚光镜的NA，整个系统的NA。更多的图像细节将在其中所有光学部件正确对准，具有相对较高的NA值并且彼此协调工作的显微镜系统中被解决。分辨率也与用于对样本成像的光的波长有关; 较短波长的光能够比较长的波长分辨更多的细节。

在处理决议时需要考虑三个数学概念：“阿贝衍射极限”，“艾里光盘”和“瑞士标准”。这些都按时间顺序列在下面。

乔治·比德尔·艾利和“艾利斑”（1835）

乔治·比德尔·艾利（George Biddell Airy 1801-1892）是英数学家和天文学家。到1826年（25岁），他被任命为三一学院数学教授，两年后，他被任命为新剑桥天文台的天文教授。从1835年到1881年，他是“天文学家*”，他有一个月球和火星火山口以他的荣誉命名。

同样在1835年，他在剑桥哲学社会交易会上发表了一篇题为“关于圆形玻璃的衍射”的论文。艾里从天文学家的角度非常地写了这篇文章，他描述了“在一个好的望远镜上看到的星星的形象和光线的形状和亮度”。尽管在不同的科学域写作，但这些观察结果与其他光学系统和显微镜相关

的艾里斑是可以通过一个圆形孔在通过衍射限制的*对准的系统来确定的光的佳聚焦点。从上图（图1）可以看出，这是一个亮点，它们是同心环或波纹（更准确地称为通气图案）。

衍射图案由光的波长和光通过的孔的大小确定。Airy Disc的中心点包含大约84％的发光强度，其余16％在衍射图案周围。当然，用显微镜观察到的样本中有许多光线，而且像“Airy Disc”一词所描述的那样，更适合多种艾里模式而不是单点光。

如图1下半部分所示的艾里模式的三维表示也称为“点扩展函数”。

恩斯特·阿贝和“阿贝的衍射极限”（1873）

恩斯特·卡尔·阿贝（Ernst·Karl·Abbe 1840-1905年）是德数学家和物理学家，1866年，他遇到卡尔·蔡司，并共同创立了所谓的“蔡司光学工程”，现在被称为蔡司。此外，他还于1884年共同创立了Schott Glassworks。阿贝也是*个定义术语数值孔径的人。1873年，阿贝出版了他的理论和公式，解释了显微镜的衍射极限。阿贝认识到标本图像由多个重叠的多重强度的衍射极限点（或艾里版）组成。

为了提高分辨率（d =λ/ 2 NA），必须使用较短波长（λ）光或通过具有较高折射率的成像介质或具有高NA的光学部件（或，实际上是所有这些因素的组合）。

然而，即使考虑到所有这些因素，由于整个系统的复杂性，波长在400nm以下的玻璃的传输特性以及在完整的波长下达到高的NA，实际显微镜系统的限制仍然有限制显微镜。理想光学显微镜中的横向分辨率限制在约200nm，而轴向分辨率约为500nm（例如分辨率限制，请参见下文）。

约翰·威廉·斯特拉特和“瑞利标准”（1896）

约翰·威廉·斯特鲁特（John William Strutt），3rd Baron Rayleigh（1842-1919）是英物理学家和多产作家。他在一生中写了惊人的466篇出版物，其中包括430篇科学论文。他写了一系列广泛的主题，如鸟飞，心理研究，声学等，并于1895年发现了氩气（他于1904年被授予诺贝尔物理学奖）。

瑞利建立并扩大了乔治·艾里的作品，并于1896年发明了“瑞利标准”的理论。瑞利标准（图2）定义了衍射受限系统中的分辨率极限，换句话说，当两点光可以区分或相互分离。

使用艾里光盘的理论，如果来自两个单的艾里版光盘的衍射图案不重叠，则它们很容易区分，“很好地解决”，据说符合瑞利标准（图2，左图）。当一张艾里光盘的中心直接与另一张的衍射图案的*个小值重叠时，它们可以被认为是“刚刚解决”，并且仍然可以区分为两个立的光点（图2，中间）。如果艾里光盘比这更接近，那么它们不符合瑞利标准，并且“未被解析”为两个不同的光点（或标本图像中的单细节;图2右侧）。

图2：由两个单的艾菲片重叠衍射图所示的分辨率极限（由瑞利标准定义）：
左：解决中：刚解决右：未解决

如何计算显微镜的分辨率

考虑到上述所有理论，很明显，在计算理论分辨率极*，需要考虑许多因素。分辨率也取决于样本的性质。我们来看看使用阿贝的衍射极限计算分辨率，并使用瑞利标准。

先，应该记住：

NA = n x sin α

其中n是成像介质的折射率，α是物镜 的角孔的一半。物镜的大角度孔径约为144º。该角度的一半的正弦为0.95。如果使用折射率为1.52的油的浸没物镜，物镜的大NA将为1.45。如果使用“干式”（非浸没）物镜，物镜的大NA将为0.95（空气的折射率为1.0）。

横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：

d =λ/ 2 NA

其中λ是用于成像样品的光的波长。如果使用514nm的绿光和NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将为177nm。

轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：

d = 2λ/ NA²

再次，如果我们假设波长为514nm，以NA值为1.45的物镜观察样品，则轴向分辨率将为488nm。

瑞利标准是基于阿贝的衍射极限的一个略微改进的公式：

R =1.22λ/ NAobj + NAcond

其中λ是用于成像样品的光的波长。NAobj是物镜的NA。NAcond是聚光镜的NA。“1.22”的数字是一个常数。这是从瑞利关于贝塞尔功能的工作得出的。这些用于计算诸如波传播的系统中的问题。

考虑到聚光镜的NA，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和载玻片之间的成像介质。假设聚光镜的角度孔径为144°，则NAcond值将等于0.95。

如果使用514nm的绿光，NA为1.45的油浸物镜，NA为0.95的聚光镜，则（理论）分辨率极限为261nm。

如上所述，用于对样本进行成像的光的波长越短，则将更多的细节被解决。因此，如果使用400nm光的短可见波长，使用NA为1.45的油浸物镜和NA为0.95的聚光镜，则R将等于203nm。

为了在显微镜系统中实现大（理论）分辨率，每个光学部件应该具有高的NA可用（考虑角度孔径）。此外，使用较短波长的光来观察样品会增加分辨率。后，整个显微镜系统应该正确对齐。