(一)费氏弧菌发光杆菌材料与方法的选择
临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等;核酸分离与纯化的方法非常多,如何恰当地收集与准备材料,选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是zui终的目的,不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求;至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑;在不影响核酸质量的情况下,应选择安全无毒的试剂与方案。
(二)选择的原则
核酸分离与纯化的方法很多,应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法,都应遵循总的原则:一是保证核酸一级结构的完整性,因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的zui基本的要求;二是尽量排除其它分子的污染,保证核酸样品的纯度,这是本章讨论的主要内容。
(三)核酸完整性的保持
为了保证核酸的完整性,在操作过程中,首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多,包括物理、化学与生物学的因素,其中有些是可以避免的。如过酸或过碱,对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用,费氏弧菌发光杆菌在核酸的提取过程中,采用适宜的缓冲液,始终控制pH在4~10之间,就可以很好地避免其危害;另外如高温加热,除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外,还可能因煮沸带来液体剪切力,因此核酸提取常常在0~4℃的条件下进行。
其次对无法避免的有害因素,应采取多种措施,尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤,缩短提取的时间,减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏; DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子,费氏弧菌发光杆菌若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作,基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点,决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
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