组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物D-苏式-鞘胺醇C-18,在SPHK1激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下,受到SPHK1磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析组织裂解样品中SPHK1活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或*纯化酶样品中SPHK1激酶特异活性的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。
技术背景
鞘胺醇激酶(Sphingosine kinase;SPHK1;EC2.7.11.13),属于脂类激酶(lipid kinase)类,包括神经鞘氨醇激酶(ceremide kinase)、二酰甘油激酶(diacylglycerol kinase;DAGK)和磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase;PI3K)等,在原生动物、酵母、植物、哺乳动物等具有进化保留,其中哺乳动物有2个同工酶:SPHK1和SPHK2,SPHK1分子量小,但活性高。SPHK1主要在肺、肝、脾脏等高度表达,而SPHK2主要在肝脏和心脏高度表达。SPHK主要在胞浆里,通过磷酸化鞘胺醇(Sphingosine),产生鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate;S-1-P),一种具有强力生物活性的鞘脂类分子(sphingolipids),成为细胞繁殖、分化、运动、存活、免疫细胞活化、钙离子信号通路、细胞骨架重构、发育形态变化等重要的调节性信使分子。由此成为抗炎、抗癌和其它病理条件治疗的重要药物靶标。基于底物D-苏式-鞘胺醇C-18(D-erythro-Sphingosine C-18),在SPHK1激酶敏感性抑制剂SKI5C(2,2-dimethyl-4S-(1-oxo-2-hexadecyn-1-yl)-1,1-dimethylethyl ester-3-oxazolidine carboxylic acid)存在与否的情况下,受到SPHK1激酶的磷酸化,获得产物鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate;S-1-P)和ADP,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析鞘胺醇激酶1的特异活性。其反应方式为:
产品内容
清理液(Reagent A) | 毫升 |
裂解液(Reagent B) | 毫升 |
缓冲液(Reagent C) | 毫升 |
酶促液(Reagent D) | 微升 |
反应液(Reagent E) | 微升 |
底物液(Reagent F) | 微升 |
阴性液(Reagent G) | 微升 |
专性液(Reagent H) | 微升 |
说明书 | 1份 |
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月
用户自备
SPHK1激酶:用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管:用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器
(微型)台式离心机:用于样品预处理
比色皿或96孔板:用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析
实验步骤
- 待测样品准备
- 手术取出动物组织,并秤重500毫克组织重量
- (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
- (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗
- (选择步骤)抽去清理液
- 移入到一个液氮冻存管
- 即刻放进液氮罐过一夜
- 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
- 放进一个15毫升锥形离心管
- 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B)
- 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
- 放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)
- 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g
- 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测
- 放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
- 测定准备
- 准备好待测样品(例如组织裂解悬液等),置于冰槽里
- 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
- 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度
- 背景对照测定
- 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升反应液(Reagent E)
- 加入xx微升底物液(Reagent F)
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入xx微升阴性液(Reagent G)
- 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
- 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
- 样品总活性测定
- 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升反应液(Reagent E)
- 加入xx微升底物液(Reagent F)
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入5微升待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白;样品须溶解)
- 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
- 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
- 样品非特异活性测定
检测开始前,移取xx微升缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
- 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
- 加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升反应液(Reagent E)
- 加入xx微升底物液(Reagent F)
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
- 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
- 计算样品活性
- 样品总活性和非特异活性计算
2)样品特异活性计算
七、酶标仪测定
1)样品总活性测定
- 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
- 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到96孔板里
- 分别加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 分别加入xx微升反应液(Reagent E)
- 分别加入xx微升底物液(Reagent F)
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 分别加入xx微升阴性液(Reagent G)或待测样品(50微克组织裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
- 活性计算:
- 样品非特异活性测定
检测开始前,移取xx微升缓冲液(Reagent C)到1.5毫升离心管,分别加入xx微升专性液(Reagent H)和待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
- 在96孔板上做好相应标记:待测样品
- 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到96孔板里
- 加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 加入xx微升反应液(Reagent E)
- 加入xx微升底物液(Reagent F)
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
- 活性计算:
- 样品特异活性计算
八、抑制剂筛选
- 在96孔板上做好相应标记:背景、*活性和待测抑制剂样品
- 按下表加入试剂,进行样品预处理
内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | *酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
缓冲液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
阴性液(Reagent G) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升(1毫单位) | xx微升(1毫单位) |
96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 (xx微升) | 样本背景孔 (xx微升) | *活性孔 (xx微升) | 待测抑制剂样品孔 (xx微升) |
轻轻摇动96孔板,混匀,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 |
- 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的96孔板的所有孔里
- 分别加入xx微升酶促液(Reagent D)
- 分别加入xx微升反应液(Reagent E)
- 分别加入xx微升底物液(Reagent F)
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 即刻放进30℃酶标仪检测:测读30分钟
- 抑制活性计算:
注意事项
- 本产品为20次操作
- 操作时,须戴手套
- 系统操作过程中,背景测定只需1次
- 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
- 样品须澄清,至关重要
- 如果出现明显的干扰现象,建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
- 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
- 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
- 光谱测定后,比色皿须清洗*
- 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
- 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升
- 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
- 可以使用SPHK1抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
- 鞘胺醇激酶1活性单位浓度定义:在30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
- 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
- 本产品经鉴定性能稳定
- 本产品经鉴定检测敏感
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