详细介绍
狗皮下微血管内皮细胞
一、细胞基本属性
细胞名称 | 狗皮下微血管内皮细胞 |
产品规格 | 5×105cells/T25细胞培养瓶 |
商品货号 | A01X2313 |
原代细胞分离培养的思路:
取材--分离--培养--鉴定
首先将组织从机体中取出,经胰dan白酶/胶原酶处理后分散成单细胞,再在合适的培养基中培养,使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。
实验步骤:
一、取7-10d雄性SD大鼠,颈椎脱臼处死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
二、在超净工作台中,将大鼠断头置于玻璃培养皿中,打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中,去除小脑和间脑。
三、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管,再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。
四、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜,保留大脑皮质。
五、大脑皮质放于DMEM中,剪碎成约1mm3大小,放入50ml的离心管中,加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型胶原酶,0 .025-0 .05%IV型胶原酶,200-400U DNaseI),混匀后37℃水浴消化1-1.5h。
六、室温1 000×g离心8min,去上清液。
七、沉淀中加入20%BSA重悬浮,充分混匀,1 000×g,20min,4℃离心,去上清。
八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的胶原酶/分散酶,0.05-0.1%I型胶原酶,100-300U DNaseI )重悬浮,混匀,37℃水浴消化0.5-1h,700×g室温离心6min,去上清液。
九、沉淀加入2ml DMEM培养液悬浮混匀,铺于经离心形成连续梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g,60min,4℃),1000×g,4℃离心10min。
十、靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段,吸出后DMEM漂洗两次(离心1000×rpm,6min,室温),去上清液。
加入DMEM培养液(20%FBS,4ug/ml素 )重悬浮,接种于含5%的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中,置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养24h后更换不含素的混合培养基,随后隔天换液。
注意事项:
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2. 在细胞培养过程中,请注意保持无菌操作。
3. 传代培养过程中,yi酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片,记录细胞状态,便于和技术部沟通;由于运输的原因,个别敏感细胞会出现不稳定的情况,请及时和我们联系,详尽告知细胞的具体情况,以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。
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