犬血管内皮生长因子（VEGF）Elisa试剂盒

实验原理：
犬血管内皮生长因子(VEGF)Elisa试剂盒应用双抗体夹心法测定标本水平。用纯化的转移酶水解酶（XTH）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中含量。

本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中的活性。
有效期：6个月
保存条件：2-8℃
仅供科研使用，不得用于临床诊断
检测前准备工作：
1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶*溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成500ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃
3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
实验所需自备试验器材：
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水
犬血管内皮生长因子(VEGF)Elisa试剂盒组成：
备注：
1.（96T/48T）打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。
2.标准品浓度依次为：200、100、50、25、12.5、0 mU/mL

样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
犬血管内皮生长因子(VEGF)Elisa试剂盒注意事项：
1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.在储存和温育时避免强光直接照射。
7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.不能使用过期产品,不同批号组分不得混用。
10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
操作步骤：
1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 
8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，    
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD      
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释      
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标      
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值                   
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释       （此图仅供参考） 
倍数，即为样品的实际浓度。                                 
试剂盒性能：
1.检测范围：6.25 mU/mL - 200 mU/mL
2.批内与批间应分别小于9%和11%灵敏度：zui低检测浓度小于1.0 mU/mL   

犬血管内皮生长因子(VEGF)Elisa试剂盒试剂盒性能：
1.检测范围：6.25 mU/mL - 200 mU/mL
2.批内与批间应分别小于9%和11%
灵敏度：zui低检测浓度小于1.0 mU/mL