鸭二胺氧化酶（DAO）Elisa试剂盒

鸭二胺氧化酶(DAO)Elisa试剂盒免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法

需要但未提供的材料及耗材
  1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml量筒
7、无粉一次性乳胶手套
 
【适用仪器】
  半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。
 
【样本要求】
  样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
 
样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
鸭二胺氧化酶(DAO)Elisa试剂盒操作程序
1、所有试剂和组分都先恢复到室温（平衡1小时），标准品、质控品和样品，建议做复孔。
2、按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
3、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
4、设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。
5、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。
6、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
7、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。
8、如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
9、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。
10、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
 
【检验结果的解释】
检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的zui终浓度。
【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于zui高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
【产品性能指标】
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。
4、灵敏度
zui低检出剂量小于1.0mIU/L。
5、回收率
三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。
6、特异性
本试剂盒识别天然和重组猪胰岛素（INS），与结构类似物无交叉。
7、稳定性

客户须知:

1、液体类标本（细胞培养上清、组织匀浆、血清、血浆、尿液、胸水、腹水、脑脊液等）。
2、样本保存：请尽早检测，2-8℃保存一天；需更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存。如需周期收集样本，请将样本及时分装标号后，置-20℃或-70℃保存；
3、请提前告诉我们：您样本的种属、样本数量、待测指标及其他特殊要求。

鸭二胺氧化酶(DAO)Elisa试剂盒承诺： 

1.有质量问题免费包换，合同上注明了的.（质量问题包括运输不当，客户在使用过程中测不出结果，等等！） 
2.全程技术指导。（包括售前的标本收集，使用过程中不明白的地方，实验结束后的数据分析，有任何疑问，我们技术都会即时给你去电） 
3.提供免费代测的服务。（你只需把标本寄过来，我们为你节省时间，帮你出结果，原始数据，分析数据均可提供，一般时间是5天左右） 
4.客户有任何问题，我们都是在一个工作日之内给出解决方案。售后和技术这一块都是竭诚为客户服务。

【储存条件及有效期】
  1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
  2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
  3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。

鸭二胺氧化酶(DAO)Elisa试剂盒常见问题分析
Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色

溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定*。

 Q2.标曲和样本均不显色

在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
 推荐孵育阶段，使用ELISA的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

 Q3.标曲显色，样本不显色

当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度zui高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

 Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大

这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的*性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。

Q5.本底偏高，样本值测不到

标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
 在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。

 Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大

有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后，计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢？
 这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时，血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触，基质效应较明显。而经过稀释后，干扰因素也随之稀释，影响就会较小。当某两个梯度稀释后，计算得到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时，样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本，经过多倍稀释后，就更加测不到了，此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

 Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液，其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的组分，有可能对结果产生影响。