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用流式细胞术检测血小板相关抗体

阅读:540          发布时间:2019-3-18
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一种能够通过胎盘存在于血小板表面的免疫球蛋白,被称为血小板相关抗体(PA-IgG)。本实验来源「实用流式细胞术彩色图谱」 王书奎、周振英主编。
实验方法原理    一种能够通过胎盘存在于血小板表面的免疫球蛋白,被称为血小板相关抗体(PA-IgG)。
实验材料    羊 F(ab+)2 2 IgG-PE抗体血样
试剂、试剂盒    洗涤缓冲液
仪器、耗材    流式细胞仪
实验步骤    
一、试剂

洗涤缓冲液(PBS/EDTA/BSA),PBS 缓冲液,含 10 mmol/L EDTA 和 0.5% BSA。

抗体:羊 F(ab+)2 抗-人 IgG(Fc Sp)-R-PE(H10104,Caltag 为多克隆抗体)。

阴性对照:羊 F(ab+)2 2 IgG-PE(11304,Caltag)。

二、样本

正常人血样 1 份,血小板数值在正常范围,具体数目不详。

患者血样 2 份,为 1 个月龄的双胞胎患者 1 和患者 2,均为贫血血小板,具体数目不详。

三、步骤

1. 用含 EDTA 抗凝剂的血液收集管采血,3 个血样均取 2 ml,分别加到 3 支流式标准管中。

2. 离心 500 r/min,将上清(富血小板血浆)转到另外 3 支流式标准管中。

3. 离心 2500 r/min 3 min。吸去血浆,用与血浆等体积的洗涤缓冲液重悬血小板。如果必要,可用旋涡混合器混匀。

4. 用洗涤缓冲液洗涤血小板 3 次,每次离心 2500 r/min 3 min。

5. 适量洗涤缓冲液重悬血小板,用血球计数仪测定血小板的浓度,其中正常血样血小板计数为 2000 /ul,患者 1 的血小板数为 6000 /ul,患者 2 的血小板数为 7000 /ul(稀释浓度)。

6. 每个含重悬血小板的流式标准管分为两管。A 管为检测管,B 管为阴性对照管,共 6 只管。正常人血样分别取 250 ul 于 2 支 流式标准管(A 管和 B 管)中,每管血小板总数为 5x106。分别取 80 ul 患者 1 的血样于 2 支流式标准管(A 管和 B 管)中,每管血小板总数为 4.8x106。分别取 70 ul 患者 2 的血样于 2 支流式标准管(A 管和 B 管)中,每管血小板总数为 4.9x106。

7. 将上述 6 支流式标准管,于 A 管均加 5 ul 羊 F(ab+)2 抗-人 IgG(Fc Sp),B 管均加 5 ul 羊 F(ab+)2 IgG。

8. 室温,避光孵育 15 min。用洗涤缓冲液再洗 1 次,方法同步骤 4。

9. 去上清,加 0.5 ml 洗涤缓冲液重悬,上机分析。

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