辣根过氧化物酶（HRP）标记套装

保存条件：HRP（辣根过氧化物酶）-20度保存，透析袋2－8度处理。其他常温保存。

产品说明：本套装是将HRP标记的常用试剂集合为一体而成。本操作流程为经碘的高碘酸氧化法。适合于蛋白等含有氨基物质的标记。特别是抗体的标记。

如果待标记物分子量太小（如小于15KD），可能会穿过透析袋而造成样品损失。

标记原理：在低PH下使RP经NaIO４氧化后形成的醛基可蛋白等分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４还原生成稳定的酶标记物。

操作方法：

一，  标记量的计算：HRP（辣根过氧化物酶）分子量为40KD左右。一般为HRP：待标记物＝2：1到4：1之间。比如抗体IgG分子量一般为150－160KD。则10mg HRP可标记抗体在10mg-20mg之间。

二，  计算好各步反应时间。作好开始标记的准备工作，是从下午开始。将HRP（辣根过氧化物酶）一共10mg加入1ml双蒸水溶解。溶解后可放－20度存放一个月。如果想作两次标记，可适当称量5mg。但并不推荐称量更小的质量。以免产生更大误差。而且透析袋一般也只够两次用量。

三，  剪切合适长度透析袋，用双蒸水清洗三次备用。透析袋分宽窄两种，适合于不同量样品的透析，请自己安排。称取21.3mg NaIO４，加入0.5ml双蒸水溶解(现配现用，浓度为0.2M)，将100mM乙酸钠（PH4.4）用双蒸水稀释100倍成1mM乙酸钠（PH4.4）。准备待标记物，如果待标记物本身盐含量很低并且缓冲力差，如生理盐水，可等二天再准备。如果不确定，将0.2M PH9.5 CB稀释20倍（请不要一次稀释完，留1－2ml左右备用），作为透析液，将待标记物装入透析袋中4℃透析过ye，透析袋适当留长约2ml体积的量以备第二天加入酶（透析袋使用请见附录）。

四，  以一次标记完为例，如果标记量小，可按比例减小试剂的用量。取0.2ml现配的NaIO４溶液加入HRP溶液中，混匀，避光常温反应两小时。装入透析袋中，在稀释过的乙酸钠（PH4.4）溶液中4℃透析过ye（透析袋使用请见附录）。

五，  第二天早上，如果样品为固体，可用水溶解，加入1/20体积的0.2M PH9.5 CB，混匀。取出活化好的HRP装入一适合离心管中，加入50ul  0.2M PH9.5 CB，混匀，立刻加入待标记物中，混匀。避光常温反应两小时。

六，  加0.1ml新配的10mg／ml NaBH４液，混匀，常温半小时。

七，  配制合适的透析液，如生理盐水或者PBS等。透析酶标记物。

八，  如果有条件进一步纯化，可透析半天后去进一步纯化，如果不纯化，请在4℃透析至少24小时。勤换液。

附透析袋使用方法：

本透析袋已预处理过，用双蒸水清洗后将水用适当吸一下。就可直接使用。透析袋上下都可以用铁夹，但如果铁夹不够用，下部可用细线或者其他的透析袋夹。

将透析袋轻轻的折上两到三折。用线或者透析袋夹封住，上面支开，加入待透析物，留一定量的空气在顶上，并小心的折一折，用铁夹夹住，轻轻的挤压，如没发现有液体流出，可放入透析液中。一般透析可用纯净水瓶去顶使用。用一次性筷子或者其他合适物穿过铁夹，将透析袋吊在透析液中，补充透析液，使透析液盖过透析袋中的液面而不要淹过铁夹下面。