一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒

保存条件：

-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。如果经常使用，FITC-dUTP和5×ReactionBuffer可放2-8℃保存。

产品简介：

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡早期检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT--mediateddUTPNick-EndLabeling)法检测细胞凋亡的原理。

操作步骤

1.a.对于细胞片或者冰冻切片,常规固定,PBS或HBSS洗涤3次（可选步骤：用含0.1％ Triton X-100的PBS孵育2分钟。）。
b.对于石蜡切片,常规脱蜡透水,滴加20μg/ml蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的*作用温度和时间需自行摸索)。PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

2．配制TUNEL检测液：按比例,每个样品,取10ul 5×Reaction Buffer,加入38ul ddH2O，加入1ul FITC-dUTP,加入1ul TdT酶,混匀。（如果zui后背景较深，可适当减少FITC-dUTP和TdT酶）

3．在样品上加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育30-60分钟。配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。注意：孵育时需注意保湿,尽可能的在湿盒中孵育,以减少TUNEL检测液的蒸发，如果标本较小，可适当的减少试剂的用量。

4．PBS或HBSS洗涤2次。

5．用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

6．对于悬浮细胞或细胞悬液：可以收集不超过10⁶个细胞，同样固定，清洗，染色，清洗，zui后用250-500μlPBS或HBSS悬浮，流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。

常见问题:

1．出现非特异性荧光标记。
a．有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b．使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。

c．TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。

2．荧光背景很高。
a．支原体污染。
b．高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
c．TUNEL反应过强。减少酶和FITC-dUTP的加入量。
d．红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。

3．标记效率低。
a．使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
b．固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。

c．在加标记液衣，可以用含0.1％ Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
d．荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。
e．碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。